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125. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie

Deutsche Gesellschaft für Chirurgie

22. - 25.04.2008, Berlin

Gentransfer in isolierten Langerhans-Inseln mit einem lentiviralen Vektorsystem

Meeting Abstract

  • corresponding author R. Meisterfeld - Klinik und Poliklinik für Viszeral-, Thorax und Gefäßchirurgie der Universitätsklinik
  • F. Ehehalt - Klinik und Poliklinik für Viszeral-, Thorax und Gefäßchirurgie der Universitätsklinik
  • K.P. Knoch - Abteilung für Experimentelle Diabetologie der Medizinischen Fakultät
  • E. Wündrich - Klinik und Poliklinik für Viszeral-, Thorax und Gefäßchirurgie der Universitätsklinik
  • H.J. Schnittler - Institut für Physiologie der Medizinischen Fakultät
  • H.D. Saeger - Klinik und Poliklinik für Viszeral-, Thorax und Gefäßchirurgie der Universitätsklinik
  • M. Solimena - Abteilung für Experimentelle Diabetologie der Medizinischen Fakultät

Deutsche Gesellschaft für Chirurgie. 125. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie. Berlin, 22.-25.04.2008. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2008. Doc08dgch8929

Die elektronische Version dieses Artikels ist vollständig und ist verfügbar unter: http://www.egms.de/de/meetings/dgch2008/08dgch434.shtml

Veröffentlicht: 16. April 2008

© 2008 Meisterfeld et al.
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Gliederung

Text

Einleitung: Seit einigen Jahren ist mit der Transplantation von isolierten humanen Inseln eine zellbasierte Therapie des Typ I Diabetes mellitus möglich. Diese ist allerdings durch eine Vielzahl von Problemen limitiert: eine unzureichende Anzahl von Spenderorganen, Nebenwirkungen durch die notwendige Immunsuppression und ein unzureichendes Transplantatüberleben. Gezielte genetische Veränderungen der zu transplantierenden Inseln kann helfen diese Probleme zu umgehen. Replikationsdefiziente lentivirale Vektoren haben gegenüber anderen Vektoren den Vorteil einer stabilen Transduktion von differenzierten Zellen bei geringerer Zelltoxizität und könnten sich zur genetischen Veränderung von intakten Inseln eignen. In unserer Studie haben wir die Transduktionseffizienz und den Einfluss des lentiviralen Vektors auf die Funktion einer Insulinomazelllinie (INS1) und isolierte Inseln (Ratte) untersucht.

Material und Methoden: Replikationsdefiziente, VSV-G-pseudotypisierte Lentilox-Viren mit dem CMV-Promotor und dem konstitutiv exprimierten Reportergen GFP (pLL3.7-GFP) wurden in 293T-Zellen produziert, durch Ultrazentrifugation konzentriert und der Titer mit einem p24-ELISA bestimmt. INS1-Zellen und isolierte Inseln wurden mit 5, 10, 20 oder 40 Transduktionseinheiten/Zelle (TU/cell) inkubiert. Die GFP-Expression wurde mittels Konfokal-Mikroskopie, Westernblot und Fluoreszenzmessung in Zellextrakten bestimmt. Das Ausmaß der transduktionsinduzierten Apoptose wurde mit einem Caspase3/7-Enzym-Assay bestimmt. Die Messung des Glucose-Stimulationsindex erlaubt Rückschlüsse auf die Sekretionsfunktion der β-Zellen.

Ergebnisse: In INS1-Zellen ergab sich mikroskopisch eine Transduktionseffizienz von 90% (GFP-positive Zellen/totale Zellzahl) bei 10 TU/cell. In Westernblot und Fluoreszenzmessung ließ sich eine starke GFP-Expression nachweisen. Die glukosestimulierte Insulinsekretion sinkt dabei allerdings auf ca. 50%, im Vergleich zu nichttransduzierten Zellen ab. Unterschiede in der Apoptoserate waren nicht signifikant. Ratteninseln zeigen nach Transduktion mit bis zu 40 TU/cell mikroskopisch lediglich periphere GFP-Expression, während der Kern der Insel weitgehend GFP-frei bleibt. Im Westernblot lässt sich GFP, ebenso wie in der Fluoreszenzmessung nur schwach nachweisen. Schon bei einer Viruslast von 10 TU/cell war eine verstärkte Apoptose zu beobachten.

Schlussfolgerung: In INS1-Zellen ist der hier verwendete lentivirale Vektor bezüglich der Transduktionsrate geeignet für den Gentransfer. Einbußen bei der Sekretionsfunktion sind limitierend für die experimentelle Aussagekraft des Systems. Eine effiziente Transduktion von intakten Inseln scheint nach unserem Protokoll nicht möglich zu sein. Weiterhin ist die lentivirusinduzierte Apoptoseaktivität limitierend für dessen Verwendung.