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125. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie

Deutsche Gesellschaft für Chirurgie

22. - 25.04.2008, Berlin

HTx-Überlebenszeitverlängerung durch Langzeitexpression löslicher Spender-MHC Klasse I-Antigene und viralem IL-10 in der Leber durch AAV-Plasmid-vermittelten Gentransfer im Rattenmodell

Meeting Abstract

  • corresponding author A. Doenecke - Klinik und Poliklinik für Chirurgie, Uniklinikum Regensburg, Regensburg, Deutschland
  • E. Frank - Klinik und Poliklinik für Chirurgie, Uniklinikum Regensburg, Regensburg, Deutschland
  • M.N. Scherer - Klinik und Poliklinik für Chirurgie, Uniklinikum Regensburg, Regensburg, Deutschland
  • E.K. Geissler - Klinik und Poliklinik für Chirurgie, Uniklinikum Regensburg, Regensburg, Deutschland
  • H.-J. Schlitt - Klinik und Poliklinik für Chirurgie, Uniklinikum Regensburg, Regensburg, Deutschland

Deutsche Gesellschaft für Chirurgie. 125. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie. Berlin, 22.-25.04.2008. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2008. Doc08dgch9853

Die elektronische Version dieses Artikels ist vollständig und ist verfügbar unter: http://www.egms.de/de/meetings/dgch2008/08dgch433.shtml

Veröffentlicht: 16. April 2008

© 2008 Doenecke et al.
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Gliederung

Text

Einleitung: In früheren in-vivo Gentransfer-Experimenten konnten wir zeigen, dass durch einen rAAV-vermittelten Gentransfer eine hohe Langzeitexpression löslicher Spender-MHC Klasse I-Antigene (RT1.Aa) im Rattenmodell möglich ist, die zu einer Überlebenszeitverlängerung nach Herztransplantation führt. Obwohl damit ein essentieller Schritt zur erfolgreichen Gentherapie gegangen werden konnte, ergeben sich durch den Einsatz von viralen Systemen neue Probleme. Der Weg zur klinischen Anwendung ist von mehreren Schwierigkeiten begleitet, die noch ungelöst sind. Neben den hohen Kosten sind es vor allem Nebenwirkungen sowie die Entwicklung neutralisierender Antikörper, die zum Abbruch von Studien mit rekombinanten Viren geführt haben. Eine Lösung dieses Problems könnte der Einsatz von Plasmid-DNA sein. Diese ist relativ einfach in großen Mengen herzustellen, und die beschriebenen Nebenwirkungen sind gering. Eine in-vivo Transfektion der Leber durch Plasmid-DNA konnte im Rattenmodell bereits gezeigt werden, allerdings war durch die fehlende Integration der Plasmid-DNA in das Genom eine Langzeitexpression nicht nachweisbar. Durch die Verwendung von AAV-Plasmiden, in denen die kodierenden Sequenzen zwischen die AAV-spezifischen ITRs (inverted terminal repeats) kloniert werden, könnte eine Genom-Integration möglich sein. Wir berichten hier über unsere Ergebnisse nach AAV-Plasmid-vermitteltem Gentransfer von RT1.Aa bzw. vIL-10 und anschließender HTx in der "high"-Responderkombination DA auf Lewis.

Material und Methoden: Die Konstruktion der AAV-Plasmide erfolgte durch Klonierung des entsprechenden Gens in das AAV-Plasmid pSUB201 unter Kontrolle des murinen Albuminpromoters. Die in-vivo Transfektion erfolgte mittels Injektion von jeweils 125μg Plasmid-DNA in entsprechendem Volumen (2,5% des Körpergewichts) retrograd über die Lebervenen von Lewis-Ratten. Hierzu wurde nach Laparotomie die suprahepatische V.cava inferior sowie die suprarenale V.cava ausgeklemmt. Die Transfektion erfolgte durch suprarenale Injektion in die V.cava inferior mit konsekutiver retrograder Perfusion der Leber über die Lebervenen. Die Konzentrationsbestimmung von RT1.Aa bzw. vIL10 im Serum transfizierter Ratten erfolgte mittels Elisa. Die Herztransplantation erfolgte heterotop nach Standardtechnik.

Ergebnisse: Durch in-vivo Transfektion mit AAV-Plasmiden ist eine hohe und langfristige Expresssion von Transgenen im Rattenmodell möglich. Nach Injektion von 125µg Plasmid-DNA lässt sich nach 2d ein Serumspiegel von über 1000 ng/ml RT1.Aa bzw. über 300pg/ml vIL10 nachweisen. Die Expression bleibt für mehrere Monate auf konstantem Niveau, auch 11 Monate nach Injektion lassen sich gleich bleibend hohe Serumspiegel nachweisen. Nach HTx in der „high“-responder-Kombination DA auf Lewis kommt es nach Transfektion sowohl von RT1.Aa, als auch vIL-10 zu einer Überlebenszeitverlängerung um 1-2 Tage.

Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse zeigen, dass mit AAV-Plasmid-DNA-vermitteltem Gentransfer eine funktionelle Langzeitexpression von Transgenen in der Leber möglich ist. Auf dem Weg zur klinischen Anwendung werden hierdurch viele der mit viralen Gentransfersystemen assoziierten Probleme umgangen. Aktuell untersuchen wir, ob ein entsprechender Gentransfer auch durch ex-vivo-Perfusion der Leber, z.B im Rahmen einer Lebertransplantation, möglich ist.