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Einleitung: Die Real-Time PCR ist eine hochsensitive Methode zur Genexpressionsanalyse in der experimentellen chirurgischen Forschung. Kommerziell erhältliche Primer-Kits stehen nur für ausgewählte Zielgene zur Verfügung und stellen einen erheblichen Kostenfaktor dar. Ziel des Projektes war die Etablierung eines einfachen und Kosten sparenden Algorithmus für ein selbständiges Primer-Design für die Real-Time PCR im LightCycler^®.

Material und Methoden: Mithilfe von unterschiedlichen kostenlosen Programmen („Shareware“) und Internetseiten wurde ein Algorithmus zum Design von Primer-Sequenzen für die Real-Time PCR im LightCycler^® entwickelt. Der Algorithmus wurde beispielhaft für das house keeping Gene β-Actin (Maus) durchgeführt und setzt sich aus folgenden Schritten zusammen: 1) Gen-Recherche in der NCBI Datenbank zur Ermittlung der gDNA und cDNA-Sequenzen des Zielgens (hier β-Actin). 2) Primer-Design über das Programm ApE (A Plasmid Editor, biologische Fakultät Utah). Auswahl geeigneter Sequenzen für forward- und reverse-Primer nach vorgegebenen Kriterien wie annealing-Temperatur, Länge und Primer-Komplementarität. 3) Primer-Abgleich mithilfe des Programms Ensembl Blast View, um zu überprüfen, ob die Primer auch an andere Sequenzen des Genoms binden. 4) Virtuelle PCR mit dem Programm Amplify, das nach Einspeisung der cDNA, gDNA und Primer-Sequenzen die Amplifikat-Sequenz und die optimalen PCR-Bedingungen (annealing-Temperatur, MgCl2-Konzentration) ermittelt. 5) Sequenz-Vergleichskontrolle im NCBI BLAST-Algorithmus, wobei die ermittelte Amplifikat-Sequenz eingelesen und mit der Ziel-cDNA-Sequenz in der Nukleotid-Datenbank abgeglichen wird. 6.) PCR-Etablierung im LightCycler^® nach Primer-Herstellung (TIBMOL^®). Mehrere Testläufe mit unterschiedlichen MgCl2-Konzentration und annealing-Temperaturen und Analyse des Amplifikats und ggf. entstandener unspezifischer Nebenprodukte mittels Agarosegel-Elektrophorese.

Ergebnisse: Mit dem vorgestellten Algorithmus ergab sich für β-Actin (NCBI Accession code M 12481) als forward-Primer ACGTTGACATCCGTAAAG (5’ – 3’) und als reverse-Primer CAGTTACAGTCCGCCT (5’ – 3’). Die LightCycler^® PCR (MgCl2 3 mM, annealing-Temperatur 55 °C) ergab ein spezifisches cDNA-Amplifikat mit einer Größe von 286 Basenpaaren. Die Kosten für Primer-Design und Etablierung der PRC beliefen sich auf 36 Euro gegenüber ca. 200 Euro für ein kommerzielles Produkt.

Schlussfolgerung: Die Genexpressionsanalyse mit der Real-Time PCR (LightCycler^®) nimmt heute in der chirurgischen Forschung einen hohen Stellenwert ein. Der hier vorgestellte Algorithmus zu Primer-Design und PCR-Etablierung ist einfach anzuwenden, auf beliebige andere Zielgene übertragbar und eine kostengünstige Alternative zu kommerziell erhältlichen Primer-Kits.

Abbildung 1 [Abb. 1]