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Inhibition früher Schritte der Metastasierung durch Blockade von FAK (Focal Adhesion Kinase) in vivo
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Veröffentlicht: | 15. Juni 2005 |
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Gliederung
Text
Einleitung
Die Ausbildung von Tumorzelladhäsionen und anschließende Extravasation stellen limitierende Schritte der organspezifischen Metastasierung dar. Die „Focal Adhesion Kinase" (FAK) nimmt hierbei eine wichtige Stellung in der intrazellulären Signaltransduktionskette während Zelladhäsion und -migration ein, die insbesondere durch die einwirkenden Scherkräfte in zirkulierenden Tumorzellen moduliert werden kann. Der intrinsische FAK-Inhibitor FRNK (FAK-related-non-kinase) wurde in hepatozellulären (HEP G2) und Kolonkarzinom-Zellen (HT-29) überexprimiert, um die Rolle von FAK in frühen Schritten der Metastasierung in vivo zu untersuchen.
Material und Methoden
Die FRNK-Sequenz wurde mittels PCR von cDNA amplifiziert und in die Expressions-vektoren pcDNA3.1 und pEGFP-C3 kloniert. Die Zellen wurden transient mit dem FRNK-Plasmid (FRNK+) oder dem entsprechenden Leer-Expressionsvektor (FRNK-) transfiziert. Die funktionellen Auswirkungen auf das Zellverhalten wurden verglichen: statische Adhäsion: in Mikrotiterplatten an CIV und CI für 15-30 min; dynamische Flowbedingungen: in Flowkammer mit collagen I (CI) beschichtet, Quantifizierung der dynamischen Adhäsionsrate (DAR) und Adhäsionsstabilisierungsrate (ASR); in vitro Migration: Transwell-Assays an CIV und CI für 24 h; in vivo Intravitalmikroskopie: Fluoreszenz-Mikroskopie markierter Tumorzellen in der Mikrozirkulation der Leber für 30 min. Statistik: Student's t-Test.
Ergebnisse
Die flowzytometrische Transfektionrate lag bei 50-60% nach 24-72 h. Es zeigte sich, dass die statische Adhäsion durch FRNK unbeeinflusst blieb, während unter dynamischen Bedingungen eine drastische Reduktion der Adhäsion auftrat, die sich signifikant reduzierter DAR (FRNK+: 12±9 Zellen vs. FRNK-: 32±10 Zellen; p<0,001) und ASR (FRNK+: 55±15% vs. FRNK-: 71±7%; p<0,05). In vivo zeigten FRNK+ Zellen eine ausgeprägte Reduktion der Adhäsion und eine komplette Unterbindung der Migrations ins Parenchym und um >80% (p<0,001).
Schlussfolgerung
FAK scheint für die Stabilisierung der Zelladhäsion an extrazellulärer Matrix in vitro und in vivo erforderlich zu sein, die es zirkulierenden Tumorzellen ermöglicht, den in der Zirkulation auftretenden Scherkräften entgegenzuwirken. Diese Kinase ist damit wesentlich an der Regulation ratenlimitierender Schritte der Fernmetastasierung beteiligt. [Abb. 1]