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122. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie

Deutsche Gesellschaft für Chirurgie

05. bis 08.04.2005, München

Optimierung des aviralen Gentransfers kutaner Zellen

Meeting Abstract

  • corresponding author J. Mertens - Klinik für Plastische Chirurgie der Ruhr Universität Bochum, Bochum, Deutschland
  • A. Gerhards - Klinik für Plastische Chirurgie der Ruhr Universität Bochum, Bochum, Deutschland
  • M. Lehnhardt - Klinik für Plastische Chirurgie der Ruhr Universität Bochum, Bochum, Deutschland
  • H.H. Homann - Klinik für Plastische Chirurgie der Ruhr Universität Bochum, Bochum, Deutschland
  • D. Druecke - Klinik für Plastische Chirurgie der Ruhr Universität Bochum, Bochum, Deutschland
  • H.U. Steinau - Klinik für Plastische Chirurgie der Ruhr Universität Bochum, Bochum, Deutschland
  • L. Steinstraesser - Klinik für Plastische Chirurgie der Ruhr Universität Bochum, Bochum, Deutschland

Deutsche Gesellschaft für Chirurgie. 122. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie. München, 05.-08.04.2005. Düsseldorf, Köln: German Medical Science; 2005. Doc05dgch2904

Die elektronische Version dieses Artikels ist vollständig und ist verfügbar unter: http://www.egms.de/de/meetings/dgch2005/05dgch060.shtml

Veröffentlicht: 15. Juni 2005

© 2005 Mertens et al.
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Gliederung

Text

Einleitung

Ein effizienter Gentransfer in primäre epidermale Zellen ist in vitro derzeit nur bedingt mittels aviralem Gentransfer möglich. Liposomaler Gentransfer erreicht gegenwärtig nur bei Zelllinien effektive Transfektionsraten. Eine neue Methode ist die Nukleofektion, bei der die DNA durch spezifische elektrische Parameter und Puffer direkt in den Zellkern gelangt. In dieser Studie wurden beide Methoden miteinander verglichen.

Material und Methoden

Primäre humane Keratinozyten (HKC), humane Fibroblasten (HFB) und eine humane Keratinozytenzelllinie (HaCaT) wurden mit folgenden Reportergenkonstrukten pCMVLacZ (Beta-Galaktosidase) oder pEGFP-N1 (Green Fluorescent Protein) mittels Lipofektion 1.) FuGENE6™, 2.) Lipofektamin 2000, 3.) Dotap-Cholesterol oder 4.) Amaxa NucleofectorTM transfiziert. Nach entsprechenden Zeitpunkten wurde innerhalb von 5 Tagen die Beta-Galaktosidase-Expression mittels quantitativem Chemilumineszenz-Assay bestimmt und auf den Gesamtprotein-Gehalt des Lysates normalisiert. Zusätzlich wurde zur Bestimmung der Transfektionseffizienz eine X-Gal-Färbung, zur Untersuchung der Zellproliferation ein MTT-Test und eine Zellmorphologieanalyse im CASY®-System durchgeführt. Alle Testansätze wurden in Triplikaten erstellt.

Ergebnisse

Die Transgenenxpression war nach Nukleofektion in HKC und HFB deutlich früher (3h vs. 24h) und höher (10% vs. 0,2%) im Vergleich zum liposomalen Gentransfer nachzuweisen. Die immortalisierte HaCaT-Zellinie zeigte dagegen im Vergleich zu den Primärzellen deutlich geringere Transfektionsraten. Nach liposomalem Gentransfer blieben 80-90% der Zellen proliferativ, ohne die Zellmorpholgie zu beeinflussen, wobei durch Nukleofektion 40-50% (p<0,05) der Zellen proliferativ waren und eine Zunahme der Zellgröße festgestellt werden konnte.

Schlussfolgerung

Die Studie hat gezeigt, dass sich die Nukleofektion als sehr gute Alternative zum liposomalen Gentransfer in epidermale Primärzellen erweist, um in vitro hohe und frühe Expressionsraten zu erzielen.