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25. Jahrestagung der deutschsprachigen Arbeitsgemeinschaft für Verbrennungsbehandlung (DAV 2007)

10.01. bis 13.01.2007, St. Anton am Arlberg

TGF-beta in Thrombozyten-angereicherten Gelen induziert in Fibroblasten Signaltransduktion und Proliferation

Meeting Abstract

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  • P. Hüttinger - Landesklinikum St. Pölten, Abteilung für Plastische-, Ästhetische und Wiederherstellende Chirurgie
  • T. Aigner - Landesklinikum St. Pölten, Abteilung für Plastische-, Ästhetische und Wiederherstellende Chirurgie
  • N. Brandl - Landesklinikum St. Pölten, Abteilung für Plastische-, Ästhetische und Wiederherstellende Chirurgie
  • F. Weyer - Landesklinikum St. Pölten, Abteilung für Plastische-, Ästhetische und Wiederherstellende Chirurgie

DAV 2007. 25. Jahrestagung der deutschsprachigen Arbeitsgemeinschaft für Verbrennungsbehandlung. St. Anton am Arlberg, 10.-13.01.2007. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2008. Doc07dav42

Die elektronische Version dieses Artikels ist vollständig und ist verfügbar unter: http://www.egms.de/de/meetings/dav2007/07dav42.shtml

Veröffentlicht: 25. Juni 2008

© 2008 Hüttinger et al.
Dieser Artikel ist ein Open Access-Artikel und steht unter den Creative Commons Lizenzbedingungen (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.de). Er darf vervielf&aauml;ltigt, verbreitet und &oauml;ffentlich zug&aauml;nglich gemacht werden, vorausgesetzt dass Autor und Quelle genannt werden.


Gliederung

Text

Grundlagen: Die für eine vollständige Wundheilung notwendigen Zellreaktionen wie Zellproliferation, Differenzierung und Migration werden durch eine koordinierte Abfolge von Zytokinwirkungen gesteuert. Eine Schlüsselstellung nimmt dabei TGF-beta ein, wirkt als typischer Bindegewebs-Wachstumsfaktor auf Fibroblasten und Keratinozyten und regt ferner die Synthese einer kollagenreichen Matrix an. Der Proliferationsschub ist ein wichtiges initiales Geschehen in der Wundheilung, da dadurch, wie bei autologen Grafts künstlich eingebracht, flächendeckendes Zellmaterial entsteht. Viele dieser Wachstumsfaktoren werden durch aktivierte Thrombozyten im initialen Thrombus im Läsionsbereich bereitgestellt.

Methodik: Im vorliegenden Bericht beschreiben wir unsere Experimente zur Untersuchung der Bioverfügbarkeit von TGF-beta in Präparationen von Plasma mit angereicherten Thrombozytengehalt (Platelet Rich Plasma = PRP). PRP wurde durch Zentrifugation mit dem Magellan™ System gewonnen. Die Plasma-Fraktion mit dem buffy-layer (PRP) wurde mit Ca und Thrombin aktiviert um ein Koagulum zu erhalten. Die Spiegel von TGF-beta in diesen Fraktionen wurden mittels ELISA analysiert. Die Effekte der angereicherten Fraktion (PRP) auf das Wachstum von Fibroblasten wurden in der Zellkultur bestimmt. Wir dokumentierten das Wachstum von Fibroblasten in PRP-Gelen und auch in lazerierten Fibroblastenmonolayern und beobachteten die Geschwindigkeit mit der die Läsion durch Migration der Zellen in dieses Areal wieder geschlossen wurde. Die Effekte wurden jenen die mit nicht angereichertem Plasma erzielt wurden gegenübergestellt. Weiters untersuchten wir, ob die Schlüsselreaktion der Signaltransduktion, die durch TGF-beta ausgelöst wird unter den in PRP vorhandenen Bedingungen erfolgen kann. Diese Signaltransduktion, eine Translokation der Transkriptionsfaktoren (SMAD 2/4) in den Zellkern, nach Bindung von TGF-beta an den TGF-Rezeptor, wurde mittels Immunfluoreszenzmikroskopie verfolgt.

Ergebnisse: Unsere Versuche zeigen, dass 1. nach Aktivieren des PRP das sich bildende Gel eine hervorragende Matrix für die Proliferation von Fibroblasten darstellt und 2. die Flächendeckung nach Läsion eines Fibroblastenmonolayers in Gegenwart von PRP signifikant schneller erfolgt. Obwohl wir zu diesem Zeitpunkt nicht folgern können ob die beobachtete Stimulierung der Zellproliferation auf Zytokinwirkung und hier insbesondere auf TGF-beta zurückzuführen ist handelt es sich aber offenbar um eine signifikante Stimulierung, die auf das Anreicherungsverfahren zurückzuführen ist, da sich PPP und PRP, die zum supplementieren des Zellkulturmediums verwendet wurden, bis auf die zellulären Bestandteile nicht unterscheidet.

Um dieser Frage nachzugehen haben wir die Spiegel an TGF-beta in PRP und PPP mittels ELISA unter Verwendung eines spezifischen anti-huma-TGF-beta 1 Antikörpers gemessen. Es konnte eine zirka 8 fache Anreicherung von TGF-beta (p<0,001, ungepaarter t-Test) gemessen werden, was mit anderen Befunden übereinstimmt die die Anreicherung verschiedener andere Parameter nach Präparation von PRP mithilfe des Magellan™ Systems untersuchten. Demnach scheint die Hauptquelle von TGF-beta das Zellmaterial, Thrombozyten und Makrophagen, zu sein. Es ist anzunehmen dass die Aktivierung über die Proteasen erfolgt, die durch die Thrombozyten-Aktivierung freigesetzt werden, erfolgt.

Einen ersten Hinweis, dass TGF-beta alleine, ohne die Vielfalt der Faktoren die in dem angereicherten PRP vorhanden sind, den aktivierenden Effekt zugrunde liegen kann zeigen unsere Experimente bei denen wir die Proliferation von Fibroblasten unter Zugabe jener Konzentration, die wir in PRP gemessen haben, an rekombinantem humanem TGF-beta (rhTGF-beta) bestimmten. Zusätzlich haben wir mittels Immunfluoreszenz unter Einwirkung von rhTGF-beta die Schlüsselreaktion, die Translokation des transkriptionell aktiven SMAD Komplexes in den Zellkern verfolgt. Beide Ergebnisse bestätigten, dass die in PRP gefundenen Konzentrationen ausreichend sind um sowohl die Signaltransduktion in Gang zu setzen als auch die wünschenswerte Zellproliferation zu bewirken.

Schlussfolgerung: Es wäre eine unzulässige Vereinfachung anzunehmen, dass TGF alleine das Wundheilungsgeschehen dominant bestimmen könnte. Obwohl eine Vielzahl von Wundheilungsmodellen eindeutig belegt, dass TGF besonders beim im Gang setzen der Wundheilung, in der initialen Phase, eine profunde Rolle spielt, so beobachtet man doch bei transgenen TGF-knock out Mäusen keine deutlich gestörte Wundheilung. Es ist offenbar, dass, wie bei vielen anderen für den Organismus lebenswichtigen Leistungen, eine Redundanz der Faktoren existiert. Bei heilungsresistenten Wunden dürfte es zum Ausfall mehrerer dieser Komponenten aufgrund einer Serie von zusätzlichen Störungen, wie Infektion oder Stoffwechsellage des Patienten, kommen. Die vielzitierte Initialzündung des Wundheilungsprozesses durch TGF-beta ist in einer chronisch persistierenden Wunde nicht mehr vorhanden. Hier könnte eine genaue Kenntnis der TGF Wirkung einen gezielten Ersatz mithilfe von PRP ermöglichen und die initialen Wundheilungsprozesse wie Proliferation und Migration der Zellen wieder in Gang setzen.