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Nach erfolgreicher Etablierung dieser neuen Ringversuchs-Serie wollen wir hier auch für Kolleginnen und Kollegen, die bisher noch nicht an diesen Ringversuchen teilgenommen haben, die Ergebnisse der aktuellen Ringversuche für den PCR/NAT-gestützten Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, EHEC/STEC, Borrelia burgdorferi sensu lato, Legionella pneumophila, Salmonella enterica und Listeria spp., MRSA bzw. cMRSA, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetti, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Pneumocystis jirovecii (vorm. P. carinii) und der molekularen Resistenztestung für Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae sowie die beiden vor kurzem neu ins Programm aufgenommenen Ringversuche zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von Clostridium difficile (Toxingene) und VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken) darstellen und kurz diskutieren.

Für nähere Informationen über die Zusammensetzung der Ringversuchsproben, dem Sinn und Zweck dieser neuen Möglichkeit zur externen Qualitätskontrolle im Umfeld der Nukleinsäurediagnostik sowie zu den Eckdaten unseres flexiblen Ringversuchskonzepts sei hier auf unsere initiale Veröffentlichung in der Zeitschrift „Der Mikrobiologe“ verwiesen [1]. Gerne werden wir hier auch weiterhin in regelmäßigen Abständen und in ähnlicher Form über die Ergebnislage, Auswertung und Analyse unser zukünftigen Ringversuche berichten.

Wie bei allen anderen Ringversuchen erfolgt die Anmeldung zu ausgewählten Teilen der Reihe „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ über die Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in Medizinischen Laboratorien (INSTAND e.V.), Düsseldorf (http://www.instand-ev.de). Nach Abschluß des jeweiligen Ringversuchs werden die Ergebnisse der einzelnen Teilnehmer dort zentral erfasst und anhand von individuellen Bewertungskriterien werden die schriftlichen Zertifikate erstellt. Zusätzlich stehen für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe weiterer Informationen auch im Internet unter „http://www.udo-reischl.de“, Unterpunkt „INSTAND-Ringversuche (PCR/NAT)“, sowie auf der Homepage von INSTAND e.V. als pdf-Files zum freien Download bereit.

Neben der Aussendung von lyophilisierten Probenmaterialien zur systematischen Abprüfung von NAT-gestützten Testsystemen für derzeit 18 unterschiedliche bakterielle und fungale Zielorganismen bzw. Pathogenitätsfaktoren gab es im Rahmen dieser Ringversuchsrunde auch wieder gewisse „Highlights“.

So wurde beispielsweise im aktuellen RV 530 Chlamydia trachomatis & Neisseria gonorrhoeae eine Probe mit relativ hohen Mengen an C. trachomatis und geringen Mengen an N. gonorrhoae-Zielorganismen versandt. Interessanterweise konnten einige kommerzielle und in-house PCR-Testsysteme hier nur die DNA von C. trachomatis im Gemisch mit N. gonorrhoeae-DNA zuverlässig nachweisen.

Mittlerweile läßt sich auch in unseren geographischen Breiten innerhalb des typischen Patientenklientels bei MRSA-Isolaten eine Zunahme der Vielfalt von zirkulierenden SCCmec Varianten beobachten. In der aktuellen Ringversuchsrunde wurde in einer der 4 Einzelproben des RV 539 MRSA/cMRSA ein Methicillin-resistentes S. aureus-Isolat ausgesandt, dessen SCCmec-Kassette eine Deletion im Methicillin-Resistenzvermittelnden mecA-Gen aufwies. Diese Probe führte Methoden- bzw. Zielsequenz-bedingt bei einem Teil der aktuell eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zu falsch-negativen MRSA-Ergebnissen. Obwohl bei dieser Probe, im Vergleich zu früheren Ringversuchen mit ähnlicher Probenkonstellation, diesmal erfreulicherweise eine etwas höhere Richtigkeitsquote erzielt werden konnte, bestätigt die Beobachtung von über 16% falsch-positiven MRSA-Ergebnissen erneut die Sinnhaftigkeit und auch Notwendigkeit des im Rahmen der PCR/NAT-Ringversuchsdiskussionen bereits mehrfach thematisierten begleitenden kulturellen Nachweises von MRSA. Selbst diejenigen Anwender, die mit ihren PCR-Testsystemen diese Variante zuverlässig detektieren und korrekt als MSSA befunden konnten, sollten sich aufgrund der zuvor erwähnten Vielfalt und der Dynamik von „exotischeren“ SCCmec-Kassettentypen nicht sicher sein, dass sie auch zukünftig alle der zirkulierenden Varianten problemlos und zuverlässig erfassen werden.

In einer der 4 Einzelproben des aktuellen Ringversuchs RV 532: Bordetella pertussis befanden sich relativ hohe Mengen eines klinischen Bordetella holmesii-Isolats, das eine Genkopie des üblicherweise für den B. pertussis-Nachweis verwendeten IS481 Insertionselements aufweist. Auch solche Varianten können in unseren Breiten durchaus vorkommen und führten im Rahmen des aktuellen Ringversuchs bei zahlreichen Teilnehmern (bzw. bei den von ihnen eingesetzten Testsystemen) zu falsch-positiven PCR-Ergebnissen für B. pertussis.

Mit der Auswahl eines etwas breiteren Spektrums von relevanten Carbapenemase-Genen bestätigte sich im Rahmen des Ringversuchs RV 544 Carbapenemase-Gene erneut die Vermutung, dass viele der derzeit verwendeten kommerziellen sowie in-house Testsysteme zur molekularen Carbapenemase Detektion noch gewisse Lücken hinsichtlich der Abdeckung von unterschiedlichen Carbapenemase-Genen aufweisen. Im aktuellen Ringversuch scheint dies insbesondere für solche Isolate zu gelten, die Kombinationen unterschiedlicher Carbapenemase-Gene aufweisen. Im Umfeld der molekularen Testung von Carbapenemase-Genen unterstützt uns ja Frau Dr. Agnes Anders vom Nationalen Referenzzentrum für gramnegative Krankenhauserreger in Bochum weiterhin bei der Auswahl von relevanten aber auch „interessanten“ klinischen Isolaten.

Alle Teilnehmer sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.

Aktueller Hinweis auf neue Ringversuche: Aufgrund einiger Anfragen aus dem Teilnehmer- und Kollegenkreis werden wir versuchen zwei zusätzliche Ringversuche zu etablieren und nach erfolgreichen Probe-Ringversuchsrunden dann auch möglichst zeitnah einzuführen:

• Der aktuelle Ringversuch RV 543: Francisella tularensis soll zukünftig als kombinierter Ringversuch um den Zielorganismus Brucella spp. erweitert werden.
• Für die externe Qualitätssicherung zukünftig kommerziell verfügbarer (und damit wohl auch vermehrt eingesetzten) PCR/NAT-gestützten Nachweisverfahren für Urogenital-Infektionen planen wir die Etablierung eines neuen Ringversuchs der vom Konzept her jeweils einige der nachfolgenden Erreger in unterschiedlichen Kombinationen und Mengen innerhalb des 4er-Panels enthalten soll:

RV 547 „Uro-Panel“ zum Nachweis von:

Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis und ggf. Treponema pallidum.

Sobald wir die komplexe Probenmatrix hinreichend optimiert haben und uns geeignetes Probenmaterial in ausreichender Menge zur Verfügung steht, wird seitens INSTAND e.V. unter den aktuellen Teilnehmern der Ringversuche „Bakterien- und Pilzgenomnachweis PCR/NAT“ eine entsprechende Bedarfsanalyse (mit der Möglichkeit zur Anmeldung für Proberingversuche) durchgeführt.

Hier noch ein paar Reflexionen des Ringversuchsleiters die er sich nach der statistischen und fachlichen Auswertung der aktuellen Ringversuchsrunde wieder mal nicht verkneifen konnte: viele der seriösen Diagnostikhersteller geben sich größte Mühe bei der Testentwicklung und klinischen Evaluierung – und sind dann (zurecht) stolz auf die Leistungsdaten ihrer modernen PCR/NAT-Assays. Auffällig bei vielen der aktuellen aber auch bei einigen der früheren Ringversuche ist das unterschiedlich gute Abschneiden von Teilnehmern mit ein und demselben kommerziellen, vorkonfektionierten und teilweise auch automatisierten und/oder kartuschenartig geschlossenen Testsystemen. Die meisten dieser Assays sind zudem auch noch IVD zertifiziert – mit allen aufwändigen herstellerseitigen Vorkehrungen zur „zuverlässigen“ Durchführung und standardisierten Ergebnisinterpretation. Die auffällige „Streuung der Performance“ (bzw. das Auftreten einzelner Ausreißer) unterstreicht aus Sicht des Ringversuchsleiters umso mehr die Bedeutung der Qualitätsstandards, wie beispielsweise das regelmäßige Mitführen von geeigneten Extraktions-, Positiv- und Negativ-Kontrollen sowie Schulungen und kontrollierte Maßnahmen zur Vermeidung von exogenen Kontaminationsmöglichkeiten in PCR/NAT-Arbeitsbereichen, die u.a. im Rahmen der aktuellen RiLiBÄK, der Akkreditierung und der praxisorientiert verfassten MIQ-1 gefordert werden. Deren Sinnhaftigkeit und Stringenz mag aus Anwendersicht ja gelegentlich bezweifelt werden, wird aber in diesen Ringversuchsrunden (sozusagen von neutraler Warte aus) dennoch immer wieder aufs Neue bestätigt. Vielleicht lohnt es sich unter diesen Gesichtspunkten doch wieder mal ein Blick in die MIQ-1 oder die RiLiBÄK um hier und dort noch ungenutztes Potential auszuschöpfen…

Maximale diagnostische Sicherheit sollte doch unser aller Prämisse sein und das unnötige bzw. fahrlässige Generieren von falsch-negativen oder falsch-positiven Befunden (und vor allem deren Folgen für die betroffenen Patienten) sind durch keine methodischen oder ökonomischen Ausflüchte zu entschuldigen!

Also „nix für ungut“ liebe Kolleginnen und Kollegen, wie der Bayer so schön sagt ;-)

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt.

In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit relativ geringer Menge folgender Zielorganismen: Chlamydia trachomatis (Probe # 1715302 und Probe # 1715314), Neisseria gonorrhoeae (Probe # 1715303), Helicobacter pylori (Probe # 1715334), Borrelia burgdorferi (Probe # 1715354), Legionella pneumophila (Probe # 1715363), Salmonella enterica ser. typhimurium (Probe # 1715372), Chlamydia pneumoniae (Probe # 1715403) sowie Francisella tularensis (Probe # 1715432).

Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze, u. a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker, für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen.

An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind, und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Mit Ausnahme der zuvor erwähnten „grenzwertig positiven“ Einzelproben wurden die Mengen der entsprechenden Zielorganismen in den Probensätzen der aktuellen Ringversuchsrunde wieder relativ deutlich über der Nachweisgrenze von „durchschnittlich sensitiven PCR/NAT-Testkonzepten“ eingestellt. Diese definieren wir wie folgt: als Richtwert für die Bewertung von Ringversuchsergebnissen gilt das 10- bis 50-fache der unteren Nachweisgrenze durchschnittlich sensitiver PCR-Protokolle unter Standardbedingungen (z.B. 50 µl Block-Cycler Reaktionsansätze, 35 PCR-Zyklen, ggf. entsprechende real-time PCR-Protokolle; gut evaluierte Primersequenzen).

Bei den meisten Probenmaterialien der aktuellen Ringversuchsrunde stellen falsch-negative Ergebnisse damit einen deutlichen Hinweis auf ernstzunehmende Mängel innerhalb der eingesetzten Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion, Amplifikation und Detektion dar.

Falsch-positive Ergebnisse sind dagegen in der Regel als Hinweis auf eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung und/oder auf mangelnde Spezifität der eingesetzten Testsysteme zu betrachten.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Die Tabellen 1 (Anhang 1 [Anh. 1]) zeigen dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert) mit den entsprechenden Codenummern der Ergebnisbögen. Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in den Tabellen 2 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen und in den Tabellen 3 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der absoluten Anzahl der richtig positiven und richtig negativen Ergebnisse sowie deren prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt.

Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

Auch im Rahmen des hier diskutierten Ringversuchs waren wieder einige Auffälligkeiten hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität von bestimmten Testkonzepten, und der für den Nachweis verwendeten Zielsequenzen, zu beobachten. Diese Aspekte sind bei der Auswertung des jeweiligen Ringversuchs aufgeführt und dort auch kurz diskutiert. Zusätzlich stehen für die früheren, für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe zusätzlicher Informationen (wie die graphisch dokumentierten Ergebnisse unserer quantitativen real-time PCR-Testsysteme oder die Ergebnisse einiger kommerzieller PCR-Testsysteme) auch unter folgender Internetadresse: http://www.udo-reischl.de; Unterpunkt „Auswertung der Ringversuche“ und natürlich auch über die Homepage von INSTAND e.V. (http://www.instand-ev.de) als pdf-Files zum freien Download bereit. An dieser Stelle möchte ich mich noch einmal ausdrücklich bei den geschätzten Kolleginnen und Kollegen für ihre zahlreichen und überaus konstruktiven Kommentare und Anregungen zu den Ausführungen in dieser Ringversuchsdiskussion sowie deren tatkräftige Unterstützung bei der Konzeption und dem Aufbau neuer Ringversuche bedanken.

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis- und Gonokokken-Nachweis. Trotz der relativ geringen Erregermenge in den vier unterschiedlich zusammengesetzten positiven Proben führte auch diesmal die Verfügbarkeit gut evaluierter und zum Teil automatisierter NAT-gestützter Analysesysteme für Chlamydia trachomatis zu hohen Richtigkeitsquoten sowohl für positive, als auch für negative Befunde.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt in einer Art Verdünnungsreihe jeweils eine Probe mit ca. 5x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 1715303), eine Probe mit ca. 1x10⁴ IFU/mL (# 1715301) und eine Probe mit ca. 5x10³ IFU/mL an C. trachomatis (# 1715302), sowie eine Probe mit einer relativ geringen Menge von ca. 5x10² CFU/mL an N. gonorrhoeae (# 1715303) und eine Probe mit ca. 1000-fach höherer Menge an N. gonorrhoeae-Zielorganismen (# 1715302; ~5x10⁵ CFU/mL).

Der Übersichtlichkeit halber stellen wir bei diesem kombinierten Ringversuch (CT / NG) die Ergebniskonstellation in 7 getrennten Tabellen (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1-3) dar. Damit wird die diagnostische Performance der jeweiligen Testsysteme beim Nachweis von CT und NG aussagekräftiger (Tabelle 4: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei CT, Tabelle 6: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei NG; jeweils gefolgt von den Richtigkeitsquoten nach aufgeführten Testsystemen in den Tabellen 5 und 7).

Auch wenn die etwas schwächer positive Probe # 1715302 des aktuellen Ringversuchs nur mit ca. 5x10³ IFU/mL an C. trachomatis-Zielorganismen versetzt worden war, fand sich unter den von insgesamt 237 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis diesmal nur ein einziges falsch-negatives Ergebnis. Bei den beiden ca. 2- und 10-fach stärker CT-positiven Proben # 1715301 und # 1715303 des aktuellen Probensets wurden von den 237 Teilnehmern diesmal nur insgesamt ein falsch-negatives Ergebnis mitgeteilt. Da hier von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei den einzelnen falsch-negativen Ergebnissen vermutlich um Ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“. Die betreffenden Teilnehmer führten auf ihren Ergebnisformularen die Verwendung von kommerziellen und IVD-gelabelten Testsystemen an, mit denen aber viele andere Teilnehmer die C. trachomatis-Zielorganismen in den entsprechenden Proben problemlos nachweisen konnten…

Für die C. trachomatis-negative Probe # 1715304 wurden aus dem gesamten Teilnehmerfeld ebenfalls nur zwei falsch-positive Ergebnisse berichtet.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-Nachweises wurden für die beiden positiven Proben # 1715302 und # 1715303 (N. gonorrhoeae; ca. 5x10⁵ bzw. 5x10² CFU/mL) diesmal jedoch von 15 der insgesamt 237 Teilnehmer falsch-negative Ergebnisse für Gonokokken-DNA bei der schwach positiven Probe mitgeteilt. Erfreulicherweise wurde die relativ hoch positive Probe # 1715302 von allen bis auf einen Teilnehmer korrekt positiv befundet.

Bei den beiden GO-negativen Proben wurden jedoch von 1 bzw. 6 Teilnehmern falsch-positive Ergebnisse und ein als fraglich klassifiziertes Ergebnis berichtet. Dieser im Vergleich zu früheren Ringversuchsrunden doch überraschend hohe Anteil an falsch-positiven Ergebnissen deutet auf Kontaminationsereignisse oder wie auch immer geartete Template-Nukleinsäure Verschleppungen bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung hin. Vor allem weil im aktuellen 4er-Set die GO-negative Probe # 1715304 (mit den 6 falsch-positiven Ergebnissen) bei sequentieller Abarbeitung unmittelbar auf die beiden GO-positiven Proben folgte. Den betroffenen Laboratorien sollten diese Ergebnisse Anlass geben, ihren individuellen diagnostischen Workflow hinsichtlich der Kontaminationssicherheit während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik zu überprüfen und gegebenenfalls zu optimieren.

Angesichts der mit 5x10³ IFU/mL ehrlicherweise nicht als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen in der CT-positiven Probe # 1715302 sowie 5x10² CFU/mL an Zielorganismen in der GO-positiven Probe # 1715303 sollten falsch-negative Ergebnisse bei betroffenen Ringversuchsteilnehmern ebenfalls Anlass zur Optimierung ihrer jeweiligen spezifischen NAT-gestützten Testsysteme geben.

Da die beobachteten „Sensitivitätsprobleme“ diesmal nur äußerst marginal ausfallen, sich offensichtlich nicht auf bestimmte Testkonzepte eingrenzen lassen und sporadisch durch das ganze Portfolio der eingesetzten Testsysteme gehen, kann dem großen Rest des Teilnehmerfeldes erneut eine erfreulich gute analytische Sensitivität und Spezifität ihrer CT- und GO-spezifischen NAT-Testsysteme, sowie der angewandten Prozeduren zur Probenaufarbeitung und -prozessierung attestiert werden.

Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen scheint es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue nicht verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit den betroffenen Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung, als auf intrinsische Unzulänglichkeiten, der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Ich glaube, es ist auch für den Leser dieser Ringversuchsdiskussion weitgehend nachvollziehbar, dass wir als Organisatoren von Testkonzept- und Testplattform-übergreifenden Ringversuchen bei der Konfektionierung unserer Probenmaterialien leider nicht jede Besonderheit im Abarbeitungsprotokoll von kommerziellen Testsystemen berücksichtigen oder unterschiedliche Arten von Ringversuchsprobenmaterial für bestimmte Testsysteme bereitstellen können.

Auf diesen Umstand wurde bereits bei früheren Ringversuchen mehrfach im Zusammenhang mit den RNA-Zielsequenzen der AMPLIFIED CT Testkits oder der APTIMA COMBO 2 Testkits (Hersteller: Gen-Probe Inc.) hingewiesen. Werden von Teilnehmern bestimmte NAT-Testsysteme eingesetzt, die erregerspezifische RNA-Zielsequenzen nachweisen oder auf einem RNA-basierten Amplifikationsprozess (TMA; Transcription-Mediated Amplification, o.ä.) beruhen, so kann mit dem hier versandten Probenmaterial offiziell keine regelgerechte Abprüfung der entsprechenden Sensitivitäten unter Routinebedingungen gewährleistet werden. Aber selbst wenn das Herstellungsverfahren unserer Ringversuchsproben primär nicht auf die Stabilisierung von RNA-Molekülen hin optimiert und getestet wurde, so konnten dennoch sowohl bei der aktuellen, wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchsrunden, von vielen Teilnehmern mit RNA-gestützten Testsystemen hohe Richtigkeitsquoten erzielt werden. Aktuell wurden die C. trachomatis-Zielorganismen von allen 7 Teilnehmern mit RNA-basierten Gen-Probe-Testsystemen in den beiden stärker CT-positiven Proben erfolgreich nachgewiesen. Auch in der relativ stark GO-positiven Probe # 1715302 gelang allen Teilnehmern mit RNA-basierten Gen-Probe-Testsystemen der erfolgreiche Nachweis der Neisseria gonorrhoeae-Zielorganismen. Nur bei der sehr schwach GO-positiven Probe # 1715303 (in der zusätzlich noch relativ hohe Mengen an C. trachomatis enthalten waren) versagte der Nachweis bei 6 der insgesamt 7 Teilnehmer mit RNA-basierten Gen-Probe-Testsystemen. Da bei der Erteilung der Zertifikate ja bekanntermaßen ein falsches Ergebnis innerhalb der 4 bewerteten Ergebnisse toleriert wird, werden auch diesmal allen 7 Teilnehmern die entsprechenden Zertifikate erteilt.

Entsprechende Inhibitionskontrollen wurden von allen der insgesamt 237 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt.

Bei den ermittelten Richtigkeitsquoten für Teilnehmer mit dem Roche COBAS Amplicor, COBAS TaqMan, dem Becton Dickinson ProbeTec, Abbott RealTime CT/NG, Artus CT, LightMix CT/NG oder anderen Testsystemen muss berücksichtigt werden, dass im Rahmen dieser Ringversuchsauswertung in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1) nicht zwischen dem spezifischen Nachweis von Chlamydien und Gonokokken differenziert wurde. Mit dem Großteil dieser kombinierten Testsysteme wurden insgesamt erfreulich hohe Richtigkeitsquoten sowohl für die positiven als auch für die negativen Ergebnisse beobachtet. Um diesmal und auch zukünftig eine detaillierte Bewertung der C. trachomatis- und GO-spezifischen NAT-Komponenten dieser kombinierten Testsysteme zu ermöglichen, haben wir zusätzlich die Tabellen 4 bis 7 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2-3) angefertigt. In den Tabellen 4 und 5 sind dabei nur die C. trachomatis (CT)-spezifischen Ergebnisse und in den Tabelle 6 und 7 nur die Neisseria gonorrhoeae (GO)-spezifischen Ergebnisse dargestellt und statistisch ausgewertet.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“ bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Im handschriftlichen Kommentarfeld der Ergebnisformulare wurden unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience FluoroType CT (13x), HAIN Lifescience FluoroType NG (12x), BD Max CT/GC/TV assay (9x), GeneProof C. trachomatis PCR Kit (6x), GeneProof N. gonorrhoeae PCR Kit (5x), SeegeneAnyplex™ II STI-7 Detection (5x), Sacace Biotechnologies N. gonorrhoeae/C. trachomatis Real-TM (3x), AmpliSens C. trachomatis-FRT PCR Kit (3x), AmpliSens N. gonorrhoeae-screen-FRT PCR Kit (3x), QIAGEN artus CT/GC QS-RGQ Kit (2x), Hologic Aptima Combo 2 assay CT/GC (2x), Urethritis basic von fast-track Diagnostics (2x), VERSANT CT/GC DNA 1.0 Assay von Siemens (2x), Mikrogen Diagenode N. gonorrhoeae Real Time PCR kit (2x), Mikrogen Diagenode C. trachomatis Real Time PCR kit (1x), Mikrogen FTD Urethritis plus (1x), Amplex Hyplex STD Chlamydia und Neisseria (1x), N. gonorrhoeae Amplex Multiplex PCR-ELISA (1x), Medac/Goffin CT/NG Assay (1x), Genetrac C. trachomatis/ N. gonorrhoeae DNA Detection Kit (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID RDB2110 STD (1x), EUROIMMUN Euroarray STi-11 (1x), AmpliGnost C. trachomatis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), Immundiagnostik Kit (1x) und Liferiver C. trachomatis/ N. gonorrhoeae Real Time PCR Kit (1x).

Unabhängig von der Art des verwendeten Testsystems soll in diesem Zusammenhang auch noch einmal darauf hingewiesen werden, dass in Gegenwart von relativ hohen Mengen an Zielorganismen (bzw. deren Nukleinsäure) die interne Kontrollreaktion aufgrund der „Konkurrenzsituation“ mit der Amplifikation der eigentlichen Zielsequenz durchaus negativ ausfallen kann, obwohl keine Inhibition der PCR-Reaktion im eigentlichen Sinne vorliegt.

Bei kombinierten Testsystemen (Stichwort: Multiplex-PCR) kann ja bekanntlich auch die Gegenwart des einen Erregers oder Zielorganismus in hoher Menge die Nachweisempfindlichkeit für den gleichzeitigen Nachweis des/der anderen Erreger oder Zielorganismen im Multiplex-Reaktionsansatz negativ beeinflussen. Bei bestimmten suboptimal abgestimmten PCR/NAT-Testsystemen könnte die Zusammensetzung der Probe # 1715303 des aktuellen Ringversuchs eine solche Problemkonstellation repräsentieren und in der Konsequenz die etwas schlechteren Richtigkeitsquoten für den Gonokokken-DNA-Nachweis erklären.

Das Probenset des aktuellen Ringversuchs enthielt diesmal eine Probe mit ca. 5x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 1715313), eine Probe mit ca. 1x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 1715311), eine Probe mit ca. 5x10³ IFU/mL an C. trachomatis (# 1715314), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1715312), die ausschließlich nicht infizierte Zellen und Escherichia coli enthielt.

Wie Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 4) der statistischen Auswertung zu entnehmen ist, wurden von den insgesamt 97 Teilnehmern bei der negativen Probe # 1715312 sowie bei allen drei C. trachomatis-positiven Proben (# 1715311, # 1715313 und # 1715314) diesmal durchwegs korrekte Ergebnisse mitgeteilt. Die markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und hervorragenden Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis-Zielorganismen kann erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme sowie der aktuellen Kits und automatisierten Testplattformen zur Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Prozessierung angesehen werden.

Auch wenn mit ca. 5x10³ IFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme noch nicht erreicht oder unterschritten sein sollte, stehen mit den Rückstellproben dieses Ringversuchs RV 531 Juni 2017 den Teilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität wieder geeignete Sets zur Überprüfung und Optimierung ihrer jeweiligen NAT-gestützten Testsysteme zur Verfügung. Angesichts der nach wie vor anhaltenden Diskussion um das „Pooling“ von entsprechendem Untersuchungsmaterial bleibt der Aspekt der analytischen Sensitivität der jeweils eingesetzten Testsysteme bedeutsam.

Inhibitionskontrollen wurden von allen der insgesamt 97 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben. Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten in-house-Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf erfreulich hohem Niveau.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. folgende Testsysteme aufgeführt: GeneProof C. trachomatis PCR Kit (5x), BD Max CT/GC/TV assay (3x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis Real-TM (3x), HAIN Lifescience GenoQuick CT (2x), GenID RDB 2110-STD (2x), Genetrac DK-CHT C. trachomatis DNA Detection Kit (2x), Seegene Allplex STI Essential Assay (1x), VERSANT CT/GC DNA 1.0 Assay von Siemens (1x) und EUROIMMUN Euroarray STi-11 (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine Probe mit hoher Menge an Zielorganismen (# 1715321; B. pertussis, ~1x10⁵ CFU/ml), eine Probe mit einem IS481-positiven klinischen Isolat von Bordetella holmesii (# 1715323 mit 1x10⁵ CFU/mL), und eine Probe mit Bordetella parapertussis (# 1715324 mit 1x10⁵ CFU/mL) als verwandten Spezies. Die Probe # 1715322 enthielt diesmal keine Zielorganismen, sondern lediglich E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen.

Die Verfügbarkeit von offensichtlich inzwischen sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemen für den Nachweis von Bordetella pertussis-DNA führte diesmal sowohl bei den positiven als auch bei den negativen Proben zu relativ hohen Richtigkeitsquoten.

Wie schon im letzten Ringversuch bereitete der spezifische Nachweis von Bordetella pertussis-DNA in der Probe # 1715321 den insgesamt 155 Teilnehmern keine allzu großen Schwierigkeiten. Die 7 Teilnehmer mit falsch-negativem B. pertussis-Ergebnis bei Probe # 1715321 verwundern etwas, aber vor einer kritischen Bewertung werden wir hier erst mal die Ergebniskonstellationen der kommenden Ringversuchsrunden abwarten. Im RV 532 befand sich diesmal wieder ein IS481-positives Bordetella holmesii-Isolat, das (Methoden- bzw. Zielsequenz-bedingt) mit einigen B. pertussis-spezifischen NAT-Testsystemen kreuzreagierte. Diese Problematik spiegelt sich beispielsweise in einer Veröffentlichung französischer Kollegen wider [2].

Insgesamt betrachtet scheint aber der Vorteil einer hochsensitiven Detektion von B. pertussis und B. holmesii über die Verwendung der repetitiven IS481-Zielsequenz die Nachteile einer (eher aus akademischer Sicht wünschenswerten) Differenzierungsmöglichkeit zwischen den beiden Spezies in der PCR-Routinediagnostik mehr als aufzuwiegen. Zudem scheint in unseren Breiten B. holmesii eher selten aufzutreten [3] und Infektionen mit beiden Spezies scheinen eine gleichermaßen „behandlungsbedürftige“ Symptomatik hervorzurufen. Eine Abgrenzung zu den übrigen (IS481-negativen) Bordetella-Spezies muss jedoch aus diagnostischer Sicht stets gewährleistet sein (siehe Ringversuchsdiskussion April 2011).

Angesichts der üblicherweise sehr hohen Richtigkeitsquoten für B. pertussis-positive Ringversuchsproben und der technisch bzw. methodisch bei der Verwendung der IS481-Zielsequenz zu erwartenden Kreuzreaktion mit B. holmesii in Probe # 1715323 hat sich der Ringversuchsleiter (in enger Abstimmung mit dem Sollwertlabor) dazu entschlossen, bei der Erteilung der Zertifikate die falsch-positiven Ergebnisse bei B. holmesii nicht als falsch-negativ zu bewerten. Die 5 Teilnehmer mit falsch-positivem Ergebnis bei der B. parapertussis-positiven Probe # 1715324 und die 2 Teilnehmer mit falsch-positivem Ergebnis bei der „negativen“ Probe # 1715322 sollten jedoch intensiv daran arbeiten, die analytische Spezifität ihrer jeweiligen Testsysteme zu verbessern.

Im Rahmen der genaueren Auswertung der mitgeteilten Ergebnisse sollte der Vollständigkeit halber noch angemerkt werden, dass der RIDAGENE Borrelia PCR-Testkit (r-biopharm) neben dem qualitativen Nachweis offenbar auch eine spezifische Differenzierung von B. pertussis, B. parapertussis und B. holmesii leisten kann. Von den entsprechenden Teilnehmern wurde hier zumindest durchwegs die korrekte Speziesinformation mitgeteilt.

Inhibitionskontrollen wurden von 154 der insgesamt 155 Teilnehmer durchgeführt und Inhibitionsereignisse wurden bei dem aktuellen Probenset bei keinem der Teilnehmer innerhalb der jeweils ausgesandten vier Einzelproben beobachtet.

Wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchen verwendete knapp die Hälfte der Teilnehmer (n=57) selbstentwickelte (in house) Testsysteme oder auf dem Ergebnisformular nicht näher spezifizierte kommerzielle Testkits (n=51) mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von B. pertussis. In diesem Zusammenhang wurde von 54 Teilnehmern explizit die Verwendung der Insertionssequenz IS481, von 4 Teilnehmern die Verwendung des Pertussis-Toxin-Gens und von 3 Teilnehmern die Verwendung eines ribosomalen Gens als B. pertussis-spezifische Zielsequenz angegeben.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: GeneProof B. pertussis/parapertussis PCR Kit (11x), AmpliGnost B. pertussis/parapertussis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (5x), Autoimmun Diagnostika Gen ID Tests (4x), Seegene Anyplex II RB5 Detection (4x), Seegene Allplex Respiratory Panel 1 (2x), Ingenetix Bacto Real B. pertussis/B. parapertussis (2x), BioMerieux ARGENE Bordetella R-gene (2x), Attomol Bordetella Realtime LT (2x), Sacace Biotechnologies B.pertussis/B.parapertussis/B.bronchiseptica Real-TM (2x), fast-track Diagnostics Bordetella (1x), Meridian Bioscience illumigene Pertussis (1x), Bio-Evolution RT PCR kit B. pertussis/parapertussis (1x), Genetrac B. pertussis DNA Detection Kit (1x), AmpliSens Bordetella multi FRT PCR Kit (1x), Altona diagnostic RealStar Bordetella PCR Kit (1x), Qiagen RespiFinder RG Panel (1x) und PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x).

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 6) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben in einer Art Verdünnungsreihe. Eine Probe mit einer sehr hohen Menge an Clarithromycin-resistenten H. pylori (# 1715331; ~5x10⁵ CFU/mL), eine mit ca. zehnfach geringerer Menge (# 1715332; ~5x10⁴ CFU/mL), eine Probe mit ca. hundertfach geringerer Menge (# 1715334, ~5x10³ CFU/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1715333), die nur humanes Zellmaterial und E. coli enthielt.

Erfreulicherweise wurden alle drei H. pylori-positiven Proben (# 1715331, # 1715332 und # 1715334) von allen der insgesamt 50 Teilnehmer als richtig-positiv bewertet. Lediglich ein Teilnehmer berichtete bei der schwach positiven Probe # 1715334 ein falsch-negatives Ergebnis. Wie bereits in den letzten Ringversuchen zeigte sich erneut die Verfügbarkeit gut evaluierter NAT-gestützter Analysesysteme mit hoher analytischer Sensitivität. Für das aktuelle Probenset wurden bei keinem der Teilnehmer falsch-positive PCR/NAT-Ergebnisse durch Kreuzreaktionen o.ä. beobachtet. Inhibitionskontrollen wurden von 49 der insgesamt 50 Teilnehmer durchgeführt und von keinem Teilnehmer wurden Inhibitionsereignisse bei den 4 Einzelproben beobachtet.

Sowohl die kommerziellen, als auch die eigenentwickelten Testsysteme schnitten im aktuellen Ringversuch wieder einmal erfreulich gut ab. So erreichten die in-house Testsysteme wie auch die kommerziellen Assays Richtigkeitsqouten von annähernd 100%, was die richtig-positiven und die richtig-negativen Ergebnisse betrifft.

Bis auf 27 Teilnehmer mit spezifizierten kommerziellen Testsystemen (im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ 1x LightMix Kit von TIB Molbiol und 1x Amplidiag H. pylori+ClariR von MOBIDIAG angegeben) verwendeten die Teilnehmer zum NAT-gestützten Nachweis von H. pylori selbstentwickelte, sog. in-house Testsysteme.

Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori-Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen, innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs, mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 39 der insgesamt 50 Teilnehmer mitgeteilt, und mit Ausnahme eines einzigen Teilnehmers waren die mitgeteilten Ergebnisse der molekularen Resistenztestung auch durchweg korrekt.

Wie auch bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr in dem Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Genen und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher zwei unterschiedliche, aber relativ stark EHEC positive Proben: mit ca. 1x10⁵ CFU/mL (# 1715341: E. coli, stx_2d-positiv) und mit ca. 1x10⁴ CFU/mL (# 1715342: E. coli, stx₁-, stx₂-, eae-, hlyA- und O157-positiv) und eine Probe mit 1x10⁵ CFU/ml eines Shigella sonnei-Isolats (# 1715343). Probe # 1715344 enthielt einen E. coli-Stamm (eae-, hlyA-negativ).

Bis auf das EHEC-Isolat mit stx_2d waren im aktuellen Ringversuch keine wirklich „exotischen“ Shiga-Toxin-Gene vertreten, sodass, begründet auf die Verfügbarkeit von mittlerweile bestens etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC, bei allen Proben durchwegs hohe Richtigkeitsquoten – sowohl für positive, als auch für negative Befunde – verzeichnet werden konnten. Die beiden EHEC-haltigen Proben # 1715341 bzw. # 1715342 wurden jeweils von 124 bzw. 125 der insgesamt 133 Teilnehmer als richtig-positiv berichtet. Eine naheliegende Erklärung für die 8 falsch-negativen Ergebnisse bei der stx₁-, stx₂-, hly- und eae-positiven Probe # 17153422 gibt es aus Sicht der Ringversuchsauswertung definitiv nicht. Dieses Isolat war in relativ hoher Menge in dem Probenmaterial vorhanden und wies auch nahezu die gesamte „Klaviatur“ der klassischen EHEC Toxingene und Pathogenitätsfaktoren auf. Die 7 falsch-negativen sowie 2 fragliche Ergebnisse bei dem nur stx_2d-positiven aber hly- und eae-negativen EHEC-Isolat in Probe # 17153421 können mit einer unzureichenden Testspezifität oder -Abdeckung von unterschiedlichen Shiga-Toxin-Genen begründet sein. Bei genauerer Berachtung der aufgeschlüsselten Ergebnislage in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 7) dieses Ringversuchs fällt aber erfreulicherweise auf, dass alle der von den Anwendern spezifizierten kommerziellen Testkits sowie die meisten der eingesetzten in-house PCR/NAT-Assays das stx_2d-Gen (zumindest prinzipiell) gut erfassen.

Hier eine kleine informative Randnotiz von Herrn Prof. Dr. Alexander Mellmann aus dem Nationalen Konsiliarlaboratorium für Hämolytisch-Urämisches Syndrom (HUS) in Münster zur Relevanz des das stx_2d-Gens: Zwei Publikationen [4], [5] beschreiben stx_2d erstmals; davon sind die stx_2d-Subtypen, die durch intestinalen Mukus aktivierbar sind, häufiger mit schweren Erkrankungen assoziiert [6]. Diagnostisch lassen sich diese beiden Arten nur schwierig unterscheiden – die Unterschiede liegen am Ende der A-Untereinheit [7] und werden wahrscheinlich nicht durch die üblichen diagnostischen PCR-Testkonzepte erfasst. Stx_2d ist häufig mit O91:H21-Isolaten assoziiert; auch in der aktuellen HUSEC-Kollektion sind mehrere Isolate mit stx_2d vorhanden was u.a. auch als Beleg für die klinische Relevanz des stx_2d-Subtyps gewertet werden kann.

Die Probe # 1715344 (E. coli-Stamm, eae-, hlyA-negativ) wurde diesmal von allen bis auf einen der insgesamt 133 Teilnehmer korrekterweise als negativ befundet. Probe # 1715343, welche in der aktuellen Ringversuchsrunde ca. 1x10⁵ CFU/ml eines eines Shigella sonnei-Isolats enthielt, wurde erfreulicherweise von 127 der insgesamt 133 Teilnehmer korrekt als negativ für EHEC/STEC befundet.

Da in den meisten der teilnehmenden Laboratorien ein NAT-gestützter Nachweis von Shiga-Toxin-Genen im Umfeld der EHEC-Diagnostik primär als Kulturbestätigungstest eingesetzt wird, werden bei zukünftigen Ringversuchen auch die meisten der positiven Proben wieder relativ hohe Mengen an Zielorganismen enthalten, und der Schwerpunkt bleibt auf der Abprüfung der analytischen Spezifität der eingesetzten Testsysteme, und weniger auf der dabei erzielten unteren Nachweisgrenze.

Neben in-house Testsystemen werden zunehmend vorkonfektionierte kommerzielle Assays eingesetzt. In den Richtigkeitsquoten zeigte sich keine Über- bzw. Unterlegenheit eines Systems, was für die breite Etablierung PCR-/NAT-gestützter Testsysteme spricht. Inhibitionskontrollen wurden von 132 der 133 Teilnehmer durchgeführt, Inhibitionsereignisse wurden in keinem Fall beobachtet.

Zudem wurden von 112 Teilnehmern die Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin-Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin (eae)- und/oder Enterohämolysin (hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest in dem mitgeteilten Umfang, großteils korrekt. Lediglich zwei Teilnehmer berichteten hier ein falsch-negatives eae-Ergebnis.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: TIB Molbiol LightMix modular stx-1/stx-2/eae (6x), BD Max Enteric Bacterial Panel (4x), Altona diagnostic RealStar EHEC PCR Kit (2x), Sacace Biotechnologies EHEC Real-TM (1x), Biomerieux BioFire (1x), AmpliGnost Verotoxin 1/2 (Differenzierung) PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), Seegene Allplex Gastrointestinal Panel Assays (1x), fast-track Diagnostics (1x) und SureFood pathogen STEC screening PLUS von Congen (1x).

Nachdem die Probenauswahl des letzten Ringversuchs mehr auf die analytische Spezifität der eingesetzten Testsysteme abzielte, wollten wir uns im aktuellen Ringversuch wieder einmal auf die Prüfung der analytischen Sensitivität fokussieren. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt somit eine Probe mit einer hohen Menge an Borrelia garinii OspA Typ3 (# 1715353, ~5x10⁵ Organismen/mL), eine Probe mit etwas geringerer Menge (# 1715351, ~5x10⁴ Organismen/mL) und eine Probe mit relativ geringer Menge (# 1715354, ~5x10³ Organismen/mL). Probe # 1715352 enthielt lediglich signifikante Mengen eines E. coli K12-Stammes.

Nochmals eine kurze Rekapitulation: Mittlerweile sind 21 verschiedene dem B. burgdorferi sensu lato-Komplex zugehörige, genetisch eindeutig unterscheidbare Spezies beschrieben. Unterschiede in den zur Diagnostik herangezogenen Zielgenen können ein Problem für den PCR-/NAT-gestützten Nachweis darstellen. Gesichert humanpathogen und weit in Europa verbreitet sind B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii sowie die als neue Spezies akzeptierte B. bavariensis. Ebenfalls gesichert humanpathogen ist B. spielmanii, allerdings wurde diese Spezies bislang nur selten bei Erkrankungen (insbesondere Haut) oder in Zecken nachgewiesen. Als möglicherweise humanpathogen werden B. bissettiiae, B. lusitaniae und B. valaisiana eingestuft, alle in Europa nachgewiesen. Zu betonen ist auch die erhebliche genetische Heterogenität von B. garinii, die allein für das OspA zumindest fünf serologisch und genetisch differenzierbare Typen in Europa zeigt.

Nach dieser knappen Auffrischung zu den Ringversuchsergebnissen:

Die Detektion von Borrelia garinii in den Proben mit relativ hoher Erregerlast (# 1715353 mit ~5x10⁵ Organismen/mL bzw. # 1715351 mit ~5x10⁴ Organismen/mL) bereitete lediglich 2 bzw. 4 der insgesamt 127 Teilnehmer gewisse Probleme, sodass für beide Proben erfreulich hohe Quoten richtig-positiver Ergebnisse erreicht werden konnten. Bei einer erneut ca. zehnfach geringeren Erregerlast von ~5x10³ Borrelia garinii-Organismen/mL (Probe # 1715354) wurde bereits von 13 der insgesamt 127 Teilnehmer ein falsch-negatives Ergebnis berichtet. Ein Teilnehmer beobachtete mit seinem Borrelien-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen ein positives Ergebnis bei der negativen Probe # 17153512, die diesmal keine non-Borrelia Spirochäten sondern lediglich humanes Zellmaterial und signifikante Mengen eines E. coli K12-Stammes enthielt. Hier könnte es sich eventuell um eine Verschleppung von Borrelien-positivem Material aus der postiven Probe „1“ während der Aufarbeitung und DNA-Isolierung handeln.

Interne oder externe Inhibitionskontrollen wurden von 126 der 127 Teilnehmer mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse der PCR-Reaktion wurden im Rahmen dieser Ringversuchsrunde von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie bei den vorhergehenden Ringversuchsrunden haben auch diesmal wieder ungefähr knapp die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von Borrelien-DNA verwendet, kommerzielle Testsysteme wurden von 73 der 127 Teilnehmer eingesetzt.

Im Großen und Ganzen waren im Rahmen dieses Ringversuchs auch keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen (durchschnittliche Sensitivität ca. 97%) zu beobachten. Darüber hinaus wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: GeneProof B. burgdorferi PCR Kit (16x), HAIN Lifescience FluoroType Borrelia (4x), EliGene Borrelia RT von Elisabeth Pharmacon (3x), Attomol B. burgdorferi Realtime LT (3x), BIORON RealLine Borrelien Kit (2x), Sacace Biotechnologies B. burgdorferi Real-TM (2x), Autoimmun Diagnostika GenID Zecken Screening Kit (1x), BactoReal B. burgdorferi von Ingenetix (1x), DYNEX Real Time PCR B. burgdorferi (1x), Genetrac B. burgdorferi DNA Detection Kit (1x) und KITGEN Borrelia Kit (1x).

Wie schon beim letzten Mal hier vorab nochmals der Hinweis: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Er ist daher NICHT für die Abprüfung von immunologischen Direktnachweisverfahren wie L. pneumophila SG1 Urin-Antigen Testen o.ä. geeignet. Einzelne Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets können daher typischerweise auch relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von L. pneumophila-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 9) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben in einer Art von Verdünnungsreihe: Probe # 1715361 mit einer relativ hohen Menge an Zielorganismen (L. pneumophila SG2, ~5x10⁴ CFU/mL), Probe # 1715364 mit einer etwa zehnfach geringeren Menge an Zielorganismen (L. pneumophila SG2, ~5x10³ CFU/mL) und Probe # 1715363 mit einer etwa hundertfach geringeren Menge an Zielorganismen (L. pneumophila SG2, ~5x10² CFU/mL). Probe # 1715362 enthielt ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Letztere (negative) Einzelprobe wurde erfreulicherweise von 117 der insgesamt 119 Teilnehmer als negativ für Legionella pneumophila-DNA befundet. Zwei Teilnehmer berichteten hier ein falsch-positives Ergebnis. Da diese Probe lediglich E. coli-Zellen enthielt, ist eine Kreuzreaktion aufgrund mangelnder Spezifität des entsprechenden Testsystems bei dieser Konstellation sehr unwahrscheinlich. Vermutlich sind die falsch-positiven L. pneumophila Befunde hier durch laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung bedingt.

Die relativ stark positive Probe # 1715361 mit ca. 5x10⁴ CFU/mL an Legionella pneumophila SG2 wurde von allen 119 Teilnehmern korrekterweise als positiv interpretiert. Die etwa 10-fach geringere Menge an Legionella pneumophila-Zielorganismen in Probe # 1715364 (ca. 5x10³ CFU/mL) konnte noch von 106 Teilnehmern korrekt als positiv identifiziert werden, allerdings wurden hier bereits schon 12 falsch-negative Ergebnisse berichtet und ein Teilnehmer klassifizierte sein Ergebnis als „fraglich“. Um die Grenzen der analytischen Sensitivität auszuloten, enthielt die Probe # 1715363 eine sehr geringe Menge an Zielorganismen (ca. 5x10² CFU/mL). Für diese Probe wurden nur 62 richtig-positive Ergebnisse von den insgesamt 119 Teilnehmern berichtet. Neben 62 falsch-negativen Ergebnissen wurden die Ergebnisse bei 2 Teilnehmern als „fraglich“ bewertet.

Aufgrund der geringen Erregeranzahl in Probe # 1715363 haben wir diese Probe als „edukativ“ betrachtet und die Ergebnisse bei der Erteilung der Zertifikate hier nicht als „falsch-negativ“ gewertet. Allerdings sollte der aktuelle Ringversuch und insbesondere ein falsch-negatives Ergebnis in Probe # 1715364 zum Anlass genommen werden, die analytische Sensitivität des verwendeten Testsystems kritisch zu hinterfragen und gegebenenfalls zu optimieren.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 78 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila-DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bacterial Kit (7x), AmpliGnost L. pneumophila von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (5x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (5x), Mikrogen Diagenode Lpn-050 Kit (4x), fast-track Diagnostics Atypical CAP Kit (4x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 33 (1x), Gerbion diarella Legionella real time PCR Kit LC und TM (1x), AnDiaTec L. pneumophila RT PCR Kit (2x), Seegene Seeplex PneumoBacter ACE detection (2x), Seegene Anyplex II RB5 Detection (1x), r-Biopharm RIDAGENE Legionella (1x), Luminex NxTAG Respiratory pathogen panel (1x), ARGENE Legio pneumo/Cc r-gene (1x), ARGENE Amp-Mix (1x), Euroclone Duplica Real Time L. pneumophila Detection Kit (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x), KITGEN L. pneumophila Kit (1x), Sacace Biotechnologies L. pneumophila Real-TM (1x), Genetrac L. pneumophila DNA Detection Kit (1x) und Ingenetix Bacto Real L. pneumophila (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal drei positive Proben in einer Art Verdünnungsreihe. Eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1715371; Salmonella enterica ser. Typhimurium, ~5x10⁴ CFU/mL), eine mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1715374; Salmonella enterica ser. Typhimurium, ~5x10³ CFU/mL), sowie eine Probe mit etwa hundertfach geringerer Menge (#1715372; Salmonella enterica ser. Typhimurium, ~5x10² CFU/mL). Die vierte Probe des Sets (# 1715373) enthielt keine Zielorganismen sondern ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte diesmal bei allen 4 Proben des Ringversuchssets zu sehr hohen Richtigkeitsquoten. Vergleichbar mit manch früherer Salmonella enterica PCR/NAT-Ringversuchen waren diesmal nur zwei falsch-positive Ergebnisse bei der „negativen Probe“ # 1715373 zu beobachten. Dies deutet auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Hoffentlich bestätigt sich diese erfreuliche Beobachtung auch in den zukünftigen Ringversuchsrunden.

Zusammenfassend wurden im Rahmen dieses Ringversuchs zum NAT-gestützten Nachweis von Salmonellen von den insgesamt 27 Teilnehmern durchwegs korrekte Ergebnisse bei der Probe # 1715371 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen mitgeteilt. Lediglich die etwas schwächer positive Probe (# 1715374; Salmonella enterica ser. Typhimurium, ~5x10³ CFU/mL) wurde von zwei Teilnehmern falsch-negativ befundet und bei der sehr schwach positiven Probe # 1715372 (Salmonella enterica ser. Typhimurium, ~1x10³ CFU/mL) wurden 6 falsch-negative Ergebnisse mitgeteilt. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ von einem Teilnehmer die Verwendung des folgenden Kits aufgeführt: r-biopharm RIDAGENE Bacterial Stool Panel (6x), BD Max Enteric Panel (4x), fast-track Diagnostics (1x), Mikrogen Diagenode Gastroenteritis Bacteria Panel (1x), KITGEN S. enterica Kit (1x) und Genetrac S. enterica DNA Detection Kit (1x).

In enger Abstimmung mit unserem Sollwert-Laboratorium (Dr. U. Busch, Dr. U. Messelhäußer, Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim) werden wir weiterhin versuchen, ab und an ein etwas exotischeres Serovar von Salmonella enterica zu versenden und zumindest eine der 4 Proben mit einer relativ geringen Menge an Zielorganismen zu versetzen – auch wenn im Rahmen der gesetzlichen Vorschriften und/oder Richtlinien der einzelnen Fachgesellschaften derzeit noch keine genauen unteren Nachweisgrenzen für den NAT-gestützten Salmonellen-Nachweis festgelegt wurden.

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken. Daher werden, wie in dieser Ringversuchsrunde, auch andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe zu finden sein – so wie im Fall der Probe # 1715384, die diesmal ca. 5x10⁴ CFU/mL an Listeria ivanovii enthielt. Probe # 1715381 des aktuellen Sets enthielt eine relativ hohe Menge an L. monocytogenes (ca. 5x10⁴ CFU/mL), die erfreulicherweise von allen der insgesamt 46 Teilnehmer korrekt erfasst wurde. Probe # 1715383 enthielt mit ca. 5x10³ CFU/mL eine etwa zehnfach geringere Menge an Zielorganismen, die ebenfalls von nahezu allen Teilnehmern mit ihren jeweiligen spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert werden konnte. Lediglich ein Teilnehmerberichtete hier ein falsch-negatives Ergebnis. Erfreulicherweise wurde auch die Probe #1715382, welche ausschließlich humanes Zellmaterial und E. coli enthielt, von allen Laboratorien als „negativ“ befundet, was erneut für eine sehr gute Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden Laboratorien spricht.

Wie bereits in vorangegangenen Ringversuchsrunden wurden von den Teilnehmern ganz überwiegend Listeria monocytogenes-spezifische Testsysteme eingesetzt (n=35). Dies spiegelte sich in der Probe # 1715384 wider, welche eine signifikante Menge an L. ivanovii (5x10⁴ CFU/mL) enthielt. Zehn der insgesamt 11 Teilnehmer mit explizit Listeria spp.-spezifischen Testsystemen berichteten diese Probe korrekt als positiv. Im Umkehrschluß spricht diese Datenlage jedoch für eine erfreulich hohe Spezifität der eingesetzten L. monocytogenes-spezifischen Testsysteme. Bei diesem Ringversuch besteht nämlich explizit die Option einer differenzierten Befundmitteilung: hält ein Teilnehmer lediglich ein L. monocytogenes-spezifisches NAT-Verfahren vor, so kann er dies über den Zusatzcode [71] im Ergebnisfeld angeben, und für die Erstellung des individuellen Zertifikats seitens INSTAND e.V. werden dann auch nur die L. monocytogenes-spezifischen Ergebnisse zur Bewertung herangezogen.

Von allen 46 Teilnehmern wurden Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen verwendet. Vermeintliche Inhibitionsereignisse bei der Aufarbeitung und Analyse der Ringversuchsproben wurden nicht beobachtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Progenie RealCycler Listeria spp. (2x), Sacace Biotechnologies L. monocytogenes Real-TM (1x), Liferiver L. monocytogenes Real Time PCR Kit (1x), fast-track Diagnostics Real Time Neonatal sepsis (1x), Genetrac L. monocytogenes DNA Detection Kit (1x), AmpliSens L. monocytogenes PCR Kit (1x) und QIAGEN mericon Listeria spp Kit (1x).

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasen- oder Wundabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostischen Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie an dieser Stelle bereits mehrfach thematisiert basieren einige der derzeit etablierten eigenentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum Direktnachweis von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern, Staphylokokkenspezies-spezifischen Markern und dem mecA-Gen in der entsprechenden Nukleinsäurepräparation. Da sowohl bei S. aureus als auch bei Koagulase-negativen Staphylokokken das mecA-Gen für die phänotypische Ausprägung einer Methicillin-Resistenz verantwortlich ist, ist die Aussagekraft dieser PCR-gestützten Testsysteme für den Direktnachweis von MRSA aus nativem Patientenmaterial eingeschränkt, wenn beim Patienten eine gleichzeitige Besiedelung mit S. aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken (die als klinische Isolate zumeist mecA-positiv sind) vorliegt. Einen attraktiven Ansatzpunkt zur Lösung dieses Problems bieten sog. SCCmec-basierte PCR-Testkonzepte, die auf dem Nachweis der SCCmec-Kassette innerhalb eines für S. aureus charakteristischen Genbereiches beruhen und die relativ gut konservierte Integrationsstelle der SCCmec-Kassette im S. aureus-Genom als Zielsequenz verwenden.

Dass aber auch die SCCmec-basierten Testkonzepte gewisse Limitationen haben, konnte im Rahmen einiger früherer Ringversuche eindrucksvoll aufgezeigt werden: hier wurden bereits einige MRSA-Isolate mit selten vorkommenden SCCmec-Subtypen oder MSSA-Isolate mit einer an den jeweiligen Enden typischen SCCmec-Sequenz, aber mit einer natürlichen Deleti on des üblicherweise innerhalb der SCCmec-Kassette vorhandene mecA-Gens versandt. Auch wenn wir uns im Rahmen dieser Ringversuchsserie zum Ziel gesetzt haben primär die analytische Sensitivität und Spezifität (und somit die Routinetauglichkeit) der jeweils eingesetzten Testsysteme abzuprüfen, befand sich im aktuellen Ringversuch neben einem klassischen und unkomplizierten MRSA-Isolat auch ein derzeit noch eher selten anzutreffendes mecC positives MRSA-Isolat und ein spezielles MSSA-Isolat mit mecA-Deletion innerhalb der SCCmec-Kassette.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) der statistischen Auswertung dargestellt, enthielten die beiden positiven Proben # 1715391 und # 1715394 diesmal ein typisches MRSA-Patientenisolat (MRSA; PVL-negativ, ~1x10⁴ CFU/mL und ~1x10⁵ CFU/mL), die Probe # 1715392 jedoch ein in unseren Breiten derzeit noch etwas seltener anzutreffendes Methicillin-sensibles S. aureus-Patientenisolat mit mecA-Deletion innerhalb der integrierten SCCmec-Kassette (sog. mecA dropout-Mutante) (MSSA; PVL-negativ; ~1x10⁴ CFU/mL). Die letzte der 4 Proben, # 1715393, enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich eine nennenswerte Menge an E. coli.

Erfreulicherweise wurden im aktuellen Ringversuch bei den beiden positiven MRSA-Proben # 1715391 und # 1715394 von nahezu allen der insgesamt 302 Teilnehmer durchweg korrekt positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt. Der technische oder methodische Hintergrund des einen als „fraglich“ klassifizierten und der 3 falsch-negativen Ergebnisse bei dieser Probe ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Möglicherweise wurden PCR-Testsysteme mit unzureichender analytischer Sensitivität eingesetzt oder es ging während der Probenaufarbeitung ein gewisser Anteil der Template-DNA bei der DNA-Isolierung oder der Komplettierung der PCR-Ansätze verloren. Angesichts der mit 1x10⁵ CFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse vor allem bei Probe # 1715394 den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus begründeten Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Bei der Probe # 1715393, die diesmal ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt, wurden im Rahmen des aktuellen Ringversuchs nur von je 3 der insgesamt 302 Teilnehmer ein als „fraglich“ klassifiziertes oder ein falsch-positives MRSA-Ergebnis beobachtet. Hier liegt (auch angesichts der sequenziellen Folge direkt nach den MRSA- bzw. MSSA-positiven Proben das Auftreten eines sporadischen laborinternen Kontaminationsereignisses oder einer Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe. Wie bereits mehrfach im Rahmen dieser ausführlichen Ringversuchsdiskussionen erwähnt, sind solche „Ausreißer“ bei technisch aufwändigen Ringversuchen mit über 300 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen meines Erachtens keiner weiteren Diskussion.

Als „Highlight“ innerhalb der aktuellen Ringversuchsrunde wurde in Probe # 1715392 eine sog. mecA dropout-Mutante ausgesandt. Bei solchen speziellen MSSA-Isolaten liegt die SCCmec-Kassette zwar im S. aureus-Genom integriert vor (d.h. die SCCmec-orfX Übergangsregion, die bei den meisten der derzeit kommerziell erhältlichen MRSA-spezifischen PCR-Testsystemen als molekularer Surrogatmarker für die Anwesenheit eines mecA-Gens verwendet wird, ist in diesem Isolat vorhanden), aber innerhalb dieser SCCmec-Kassette ist das Methicillin-Resistenz vermittelnde mecA-Gen großteils deletiert und daher phänotypisch nicht mehr funktionell ausgeprägt. Auch wenn solche mecA Deletionsmutanten derzeit noch eher selten beobachtet werden, so soll mit der Mitführung dieses Isolats bei den Teilnehmern und innerhalb der Leserschaft dieser Ringversuchsdiskussion zumindest das Bewusstsein für das mögliche Vorkommen solcher MSSA-Isolate geweckt werden, die „leere“ SCCmec-Kassetten tragen.

Hier ist natürlich der direkte Vergleich zur Ergebnislage von zwei unserer früheren MRSA-Ringversuche vom November 2012 und November 2015 interessant: damals wurden nämlich die gleichen mecA dropout MRSA-Isolate ausgesandt. Im November 2012 konnten von insgesamt 210 Teilnehmern lediglich 63 Teilnehmer (30%) und im November 2015 von insgesamt 314 Teilnehmern bereits 167 Teilnehmer (53%) einen korrekt negativen PCR/NAT-MRSA Nachweis führen. In der aktuellen Ringversuchsrunde wurden bei diesem mecA dropout MSSA-Isolat immerhin schon von 254 der insgesamt 302 Teilnehmer (84%) korrekt negative PCR/NAT-Ergebnisse für MRSA berichtet. Ich denke dieser Trend ist sehr erfreulich (sowohl für die betroffenen bzw. davon profitierenden „nicht-isolierungspflichtigen“ Patienten als auch für uns Diagnostiker) und auch überzeugend – selbst ohne hier jetzt großartige Statistik- oder Signifikanz-Algorithmen bemühen zu müssen ;-).

Zugegebenermaßen sind mecA dropout-Mutanten (ähnlich wie beispielsweise auch die mecC Resistenzgene bei früheren Ringversuchsrunden) unter den MRSA bzw. MSSA Patientenisolaten noch relativ selten und die Ergebniskonstellation dieses Ringversuchs sollte den diagnostischen Wert von SCCmec-basierten PCR-Testkonzepten in der mikrobiologischen Praxis nicht schmälern. Ungeachtet des verwendeten Testsystems wurde bei der Erstellung der Zertifikate ein positives Ergebnis für die edukative Probe # 1715392 nicht als „falsch“ bewertet. Allerdings sollte bei dem aktuellen MRSA Ringversuch insbesondere ein falsch-negatives Ergebnis für die Proben # 1715391 und # 1715394 oder ein falsch-positives Ergebnis für Probe # 1715393 zum Anlass genommen werden, die analytische Sensitivität bzw. die Kontaminationsanfälligkeit des verwendeten Testsystems kritisch zu hinterfragen.

Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind und/oder überprüfen wollen, ob ihr spezifisches Testsystem mecA Deletionsmutanten bei SCCmec-Kassetten tragenden S. aureus-Isolaten erfassen kann, stehen mit den Proben dieses Ringversuchs wieder standardisierte Rückstellproben zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Darüber hinaus bestätigt das „besondere“ MSSA-Isolat der aktuellen Ringversuchsrunde erneut die Sinnhaftigkeit und auch Notwendigkeit des im Rahmen der PCR/NAT-Ringversuchsdiskussionen bereits mehrfach thematisierten begleitenden kulturellen Nachweises von MRSA.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine-Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende (PVL-negative) Ergebnisse der molekularbiologischen PVL-Testung wurden von 92 der insgesamt 302 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt und mit Ausnahme von drei falsch-positiven PVL-Ergebnissen waren diese diesmal durchweg korrekt. Nähere Informationen zu der, nach wie vor hochaktuellen, cMRSA- bzw. CA-MRSA-Problematik finden sich beispielsweise unter Linde et al. [8], oder Witte et al. [9]. Ein gut evaluiertes real-time PCR-Protokoll für den gezielten Nachweis von PVL-positiven S. aureus-Isolaten findet sich beispielsweise in Reischl et al. [10]. Mittlerweile sind auch schon einige kommerzielle real-time PCR-Testsysteme für den zuverlässigen molekulargenetischen Nachweis von PVL-Genen bei MRSA- und MSSA-Isolaten verfügbar (z.B. von r-biopharm oder von TIB Molbiol).

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience Genotype MRSA (4x), HAIN Lifescience Genotype Staphylococcus (2x), Amplex easyplex MRSA (3x), r-biopharm RIDAGENE PVL PCR (1x), GeneProof MRSA PCR Kit (1x), Greiner Bio-One Genspeed MRSA (1x), VELA diagnostics Sentosa SA Direct MRSA Test (1x), AmpliSens MRSA-screen-titre-FRT PCR kit (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID MRSA combi (1x), Congen SureFast MRSA 4Plex (1x) und Diarella MRSA real time PCR Kit TM von Gerbion (1x).

Eine wichtige Anmerkung wie immer vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben in einer Art Verdünnungsreihe. Eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1715402; C. pneumoniae, ~5x10⁵ IFU/ml), eine mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1715404; C. pneumoniae, ~5x10⁴ IFU/ml), eine Probe mit geringer Menge (# 1715403; C. pneumoniae, ~1x10⁴ IFU/ml), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1715401; nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen).

Aus den in der Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) aufgeführten Daten ist zu entnehmen, dass im aktuellen Ringversuch alle Teilnehmer die Zielorganismen in der positiven Probe # 1715402 (ca. 5x10⁵ IFU/mL) sicher und zuverlässig nachweisen konnten. Auch die zehnfach geringere Menge an Zielorgansimen der Probe # 1715404 konnte von 132 der 134 Teilnehmer korrekt als positiv befundet werden. Die sehr geringe Erregermenge in Probe # 1715403 (1x10⁴ IFU/mL) wurde noch von 129 teilnehmenden Laboratorien erfasst und korrekt bewertet. Für die Probe ohne Zielorganismen # 1715401 (Escherichia coli) dokumentierten 133 der 134 Teilnehmer ein korrektes negatives Ergebnis. Daneben fand sich für diese Probe noch ein falsch-positives Ergebnis. Dies unterstreicht einerseits aufs Neue die hohe analytische Spezifität der eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zum Nachweis von C. pneumoniae-DNA. Andererseits könnte es sich bei dem isoliert falsch-positiven Ergebnis eventuell um sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Kreuzreaktivitäten der C. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit E. coli-DNA erscheinen eher als unwahrscheinlich. Eine signifikante Inhibition der PCR-Reaktion in keiner der versandten Proben Teilnehmer beobachtet, Inhibitionskontrollen wurden von insgesamt 133 der 134 Teilnehmer durchgeführt. Selbstentwickelte in-house NAT-Testsysteme zur Detektion von C. pneumoniae-DNA wurden von 42 Labors eingesetzt, alle weiteren Teilnehmer vertrauten auf kommerzielle Assays. Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: GeneProof C. pneumoniae PCR Kit (9x), Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bakterien (5x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (4x), ARGENE Chla/Myco pneumo r-gene (3x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae (3x), fast-track Diagnostics Atypical CAP Kit (3x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 21 (2x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 33 (1x), Sacace Biotechnologies M./C. pneumoniae Real-TM (2x), M./C. pneumoniae RG detect von Institute of Applied Biotechnologies (2x), Seegene Seeplex PneumoBacter ACE Detection (2x), Seegene Anyplex RB5 detection (1x), Ingenetix Bacto Real C. pneumoniae (1x), Luminex NxTAG Respiratory pathogen panel (1x), Euroclone Duplica Real Time C. pneumoniae Detection Kit (1x), r-Biopharm RIDAGENE C. pneumoniae (1x), Vircell Speed-oligo Chlamydophila pneumoniae (1x), fast-track Diagnostics Real Time Neonatal sepsis (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x) und Genetrac C. pneumoniae DNA Detection Kit (1x).

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern des vergangenen Ringversuchs hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut, wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial, konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal zwei positive Proben: Probe # 1715412 mit einer hohen Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁵ Genomkopien/mL) und Probe # 1715413 mit eine etwa zehnfach geringeren Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁴ Genomkopien/mL). Um die Spezifität der Testsysteme abzuprüfen enthielt Probe # 1715414 diesmal nennenswerte Mengen an Haemophilus influenzae – eine zum Genus der Zielorganismen Mycoplasma verwandten Spezies. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (# 1715411), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen und probenmaterialähnlichen Proteinkomponenten enthielt.

Alle der insgesamt 149 Teilnehmer die DNA der M. pneumoniae-Zielorganismen in der relativ stark positiven Probe # 1715412 problemlos und zuverlässig nachweisen. 15 Teilnehmern gelang hingegen der Nachweis des Zielorganismus in der etwas schwächer positiven Probe # 1715413 (ca. 10⁴ Genomkopien/mL) nicht. Dies sollte zum Anlass genommen werden, die Sensitivität des verwendeten Testsystems sowie die Prozesse der Probenabarbeitung zu evaluieren. Ein Teilnehmer hat hier sein Ergebnis als „fraglich“ klassifiziert.

Bei der Probe # 1715414 mit Haemophilus influenzae wurden von 147 Teilnehmern korrekt negative Ergebnisse mit ihren jeweiligen M. pneumoniae-spezifischen Testsystemen beobachtet. Bei den 2 falsch-positiven Ergebnissen handelt es sich entweder um laborinterne Kontaminationsereignisse, um eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung oder um Kreuzreaktivitäten, die in der Verwendung von Testsystemen mit unzureichender Spezies-Spezifität begründet sind. Aus diesem Grund sollten Teilnehmer mit falsch-positiven Ergebnissen bei der Probe mit Haemophilus influenzae versuchen, die analytische Spezifität ihrer jeweiligen NAT-Testsysteme zu überprüfen und gegebenfalls nachzubessern.

Die „negative“ Probe # 1715411, die anstelle von Zielorganismen lediglich E. coli enthielt, wurde diesmal von allen Teilnehmern als negativ befundet. Dies deutet auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Hoffentlich bestätigt sich diese erfreuliche Beobachtung auch in den zukünftigen Ringversuchsrunden (und nicht nur dann, wenn sich diese negative Probe als Nummer 1 innerhalb des so versandten und vermutlich auch so abgearbeiteten 4er-Sets befindet).

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 67 Teilnehmern die Verwendung von kommerziellen Testkits aufgeführt, gravierende Unterschiede in den Richtigkeitsquoten von kommerziellen Testsystemen und „in-house“ Assays waren nicht augenfällig.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 35 Teilnehmern die Verwendung von kommerziellen Testkits aufgeführt: LightMix M. pneumoniae [n=15], Minerva Biolabs Venor Mp [n=1], AmpliGnost MP PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe [n=5], Diagenode MP/CP [n=7] und r-Biopharm RIDAGENE Mp [n=7], sowie „andere kommerzielle Testsysteme“ [n=67]. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: fast-track Diagnostics Kits (10x), GeneProof M. pneumoniae PCR Detection Kit (8x), Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bakterien (4x), ARGENE Chla/Myco pneumo r-gene (4x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (4x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae-FRT PCR Kit (3x), M./C. pneumoniae RG detect von Institute of Applied Biotechnologies (2x), Sacace Biotechnologies M./C. pneumoniae Real-TM (2x), AnDiaTec M. pneumoniae RT PCR Kit (2x), Seegene Anyplex RB5 detection (2x), Seegene PneumoBacter ACE detection (1x), Euroclone Duplica Real Time M. pneumoniae Detection Kit (1x), Sartorius Microsart AMP Mycoplasma (1x), Vircell Speed-oligo M. pneumoniae (1x), Luminex NxTAG Respiratory pathogen panel (1x), Ingenetix Bacto Real Mycoplasma pneumoniae (1x), PathoFinder RespiFinder 2Smart (1x) und Genetrac M. pneumoniae DNA Detection Kit (1x).

Auch hier wieder eine Anmerkung vorweg: Der kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii & Bacillus anthracis ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Coxiella burnetii- und Bacillus anthracis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben (Tab. 1: Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an C. burnetii (~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1715423 und ~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 1715421), eine Probe mit DNA des B. anthracis „STI“ Impfstammes (~1x10⁶ Genomkopien/mL in Probe # 1715424), eine Probe mit DNA des Bacillus anthracis UR-1 Isolats DNA (~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 1715421), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1715422), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Der Übersichtlichkeit halber haben wir uns bei diesem kombinierten Ringversuch entschlossen, die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen darzustellen: für C. burnetii in den Tabellen 2 und 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) sowie für B. anthracis in den Tabellen 4 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 16). Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Altona diagnostics RealStar Anthrax PCR Kit (3x), Sacace Biotechnologies C. burnetii Real-TM (1x), Liferiver C. burnetii real time PCR Kit (1x), ThermoFischer LSI VetMAX C. burnetii RT PCR Kit (1x) und Bacterial CNS flow chip (1x).

Coxiella burnetii: Wie bereits im vorausgegangenen Ringversuch gestaltet sich auch in der aktuellen Runde die Ergebnislage erfreulich. Die etwas stärker positive Probe # 1715421 (mit ca. 1x10⁵ Genomkopien C. burnetii/mL) wurde von allen der insgesamt 39 Teilnehmern mit ihren jeweiligen C. burnetii-spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert. Die zweite positive Probe # 1715423 des Probesets (ca. 1x10⁴ Genomkopien/mL von C. burnetii) wurde von 38 Labors korrekt berichtet, hier ist allerdings zudem ein fragliches Ergebnis zu registrieren. Dies sollte in dem betroffenen Labor zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems zu hinterfragen und die Prozesse der Probenaufarbeitung ggfs. zu optimieren. Die beiden Proben ohne Zielorganismus (# 1715422 und # 1715424 wurden erfreulicherweise von allen Teilnehmern korrekt als „negativ“ gewertet.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von C. burnetii-DNA der Teilnehmer enthielten durchwegs eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Relevante Inhibitionsereignisse wurden nicht beobachtet.

Bacillus anthracis: Die Ergebnislage des Ringversuchs „Bacillus anthracis-DNA“ ist ebenfalls relativ schnell dargestellt. Alle 22 Teilnehmer konnten die beiden Proben mit Zielorganismen (# 1715424 und # 1715421) sowie ohne Zielorganismen (# 1715422 und # 1715423) richtig klassifizieren.

Zur kurzen Rekapitulation: B. anthracis-Stamm STI ist positiv für die B. anthracis-spezifischen chromosomalen Sequenzmarker rpoB oder dhp61 und das Virulenzplasmid pXO1 (kodiert für Letal- und Ödem-Faktor, sowie Protektives Antigen pagA), jedoch negativ für das Virulenzplasmid pXO2. Wie immer stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für C. burnetii-DNA und B. anthracis-DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Francisella tularensis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 17) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben: Probe # 1715431 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (F. tularensis spp. tularensis, ~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 1715432 mit ca. zehnfach geringerer Menge (F. tularensis spp. holarctica, ~1x10⁴ CFU/mL) und Probe # 1715434 mit ca. ~1x10⁵ CFU/mL an F. tularensis spp. novicida. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (# 1715433), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Ähnlich wie bei vorausgehenden Ringversuchen haben auch hier fast alle der 26 Teilnehmer die relativ stark positiven Proben # 1715431 (F. tularensis spp. tularensis, ~1x10⁵ CFU/mL) und # 1715434 (F. tularensis spp. novicida, ~1x10⁵ CFU/mL) als positiv identifiziert. Die Probe mit der geringsten Erregermenge (~1x10⁴ CFU/mL) konnte noch von 18 der 26 Teilnehmer korrekt als positiv befundet werden. Die sieben falsch-negativen Bewertungen sowie das berichtete fragliche Ergebnis sollten Anlass geben, das verwendete Testsystem bzgl. Sensitivität zu evaluieren und ggfs. zu optimieren. Es muss kritisch angemerkt werden, dass in vorausgehenden Ringversuchsrunden auch in Proben mit geringerer Menge des Zielorganismus höhere Richtigkeitsquoten erzielt werden konnten.

Die F. tularensis-negative Probe # 1715433 wurde von allen Teilnehmern erfreulicherweise durchgehend als negativ befundet.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von F. tularensis-DNA der Teilnehmer enthielten alle eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Der seit 2015 in das reguläre Ringversuchsprogramm von INSTAND e.V. aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Carbapenemase-Gene“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zur molekularen Resistenztestung bzw. dem Direktnachweis von charakteristischen Carbapenemase-Genen aus DNA-Präparationen von Reinkulturen an Enterobacteriaceae konzipiert. Zum orientierenden Herantasten an die technische Eignung und die „Praktikabilität“ der versandten Probenmaterialien werden wir uns in den ersten Runden dieses methodisch anspruchsvollen Ringversuchs zur molekularen Resistenztestung auf die Abprüfung eines kleinen Spektrum der derzeit häufigsten Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae beschränken: KPC, VIM, OXA-48 ähnliche Gene, GES-Carbapenemasen, NDM, IMP und GIM. Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 18) der Auswertung dargestellt, enthielt das aktuelle Set drei Proben mit Carbapenem-resistenten Enterobacteriaceae: Probe # 1715441 enthielt Klebsiella pneumoniae-Zielorganismen mit dem VIM-2-Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL), Probe # 1715442 enthielt Klebsiella pneumoniae-Zielorganismen mit den Genen für KPC-2 und OXA-48 (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL) und Probe # 1715444 enthielt Serratia marcescens-Zielorganismen mit dem NDM-1-Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL). Die vierte Probe # 1715443 war als eine Art von Negativkontrolle ausgelegt – sie enthielt lediglich E. coli ohne Carbapenemase-Gene.

74 der 77 Teilnehmer stellten erfreulicherweise ein Carbapenemase-Gen in der Probe # 1715441 fest. Für die Probe mit NDM-1 positiver Serratia marcescens (# 1715444) wurden mit einer Ausnahme korrekte Ergebnisse berichtet. Hoch lag die Reichtigkeitsquote auch für die Probe # 1715442, hier berichteten 75 Teilnehmer die Probe als „Carbapenemase-positiv“, bei genauerem Hinsehen muss jedoch festgestellt werden, dass sechs Teilnehmern eines der beiden Carbapenemase-Gene (vor allem KPC-2) „durchrutschte“. Wegen des Nachweises eines weiteren Carbapenemase-Gens wurden die Proben korrekt als „positiv“ klassifiziert. Hier heißt es aufpassen und auch bei formal richtigem Ergebnis den Ursachen auf den Grund gehen! Dieser letzte Punkt sollte auch für die 2 Teilnehmer mit „falsch-positiven“ Ergebnissen für die Probe #1715443 beherzigt werden, man bedenke die klinischen Konsequenzen eines fälschlicherweise Carbapenemase-positiv berichteten Enterobacteriaceae-Isolats!

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Direktnachweis von Carbapenemase-Genen Teilnehmer enthielten mit einer Ausnahme jeweils eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID Carbapenemase (2x), AmpliGnost Carbapenemase PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), Amplex eazyplex SuperBug complete A (1x), Amplex eazyplex SuperBug complete B (1x) und GENSPEED SuperBug CR (1x).

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Clostridium difficile“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Clostridium difficile-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 20) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben drei positive Proben: Probe # 1715451 mit einen relativ hoher Menge an Clostridium difficile, (~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 1715453 und # 1715454 mit ca. zehnfach geringerer Menge (~1x10⁴ CFU/mL ) sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1715452), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die „hochpositive“ Clostridium difficile-Probe # 1715451 wurde erfreulicherweise von allen 130 teilnehmenden Laboratorien korrekt als „positiv“ klassifiziert. Auch die beiden Proben mit ca. zehnfach geringerer Erregermenge (# 1715453 und # 1715454) wurden von 128 bzw. 129 Labors korrekt berichtet. Falsch-negative Ergebnisse sollten auch hier zum Anlass genommen werden, das verwendete Testsystem bzgl. analytischer Sensitivität und Spezifität zu evaluieren und auch die laborinternen Prozesse der Probenaufbereitung und -abarbeitung kritisch zu hinterfragen. Letzteres gilt insbesondere für Teilnehmer mit falsch-positiven Ergebnissen für die lediglich E. coli-enthaltende Probe # 1715452. Eine Kreuzreaktion der verwendeten Testsysteme mit E. coli erscheint unwahrscheinlich, am ehesten sind Kreuzkontaminationen im Prozess der Probenbearbeitung ursächlich. Mit einer Ausnahme wurden Inhibitionskontrollen mitgeführt, eine nennenswerte Inhibition wurde für keine der Proben berichtet.

Wie in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 20) angegeben, verwendeten der Großteil der Teilnehmer kommerzielle Testsysteme, während selbstentwickelte Testkonzepte in 17 Laboratorien zum Einsatz kam. In dieser Ringversuchsrunde zeigten sich (vergleichbar mit der vorausgegangenen) zwischen den kommerziellen Testsystemen und den Eigenentwicklungen keine signifikanten Unterschiede bezüglich Sensitivität und Spezifität.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: HAIN Lifescience GenoType CDiff (7x), HAIN Lifescience FluoroType CDiff (2x), r-Biopharm RIDAGENE CD Toxin A/B (6x), r-Biopharm RIDAGENE Hospital Stool Panel (5x), r-Biopharm RIDAGENE C. difficile (4x), Altona diagnostic RealStar C. difficile PCR Kit (5x), AmpliGnost C. difficile Toxin A und B von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (2x), Meridian Bioscience illumigene C. difficile (2x), fast-track Diagnostics C. difficile (1x), Seegene Allplex GI-Bacteria Assay (1x), eazyplex C. difficile complete Assay (1x), Congen SureFast C. difficile 3Plex (1x) und GENSPEED C. diff OneStep (1x).

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Vancomycin-resistente Enerokokken“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an DNA Vancomycin-resistenter Enterokokken aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 21) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben drei Vancomycin-resistente Enterococcus Stämme: Probe # 1715461 (Enterococcus faecalis van A, ~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 1715462 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (Enterococcus faecium van B, ~1x10⁵ CFU/mL), und Probe # 1715463 (Enterococcus avium van A, ~1x10⁵ CFU/mL). Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (# 1715464), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Erfreulicherweise wurden die beiden „positiven“ Proben mit vanA bzw. vanB tragenden Enterococcus faecalis und E. faecium (# 1715461 und # 1715462) mit lediglich zwei bzw. 3 Ausnahmen von allen Teilnehmern als „VRE-positiv“ klassifiziert. Immerhin 7 falsch-negative Ergebnisse wurden für den vanA-tragenden E. avium-Stamm (# 1715463) eingereicht. Im Falle einer Infektion mit dem Erreger kommt dem korrekten Nachweis einer Vancomycin-Resistenz natürlich eine hohe Bedeutung zu. Wie bereits im vorangegangenen Ringversuch waren alle eingereichten vanA/vanB Differenzierungen korrekt. Die „negative“ Probe # 1715464 wurde erfreulicherweise durchwegs als „VRE-negativ“ berichtet. Bei den eingesetzten Testsystemen zeigt sich in den letzten Jahren ein Trend hin zu kommerziell erhältlichen, vorkonfektionierten Systemen. Unterschiede in Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu in-house Assays waren jedoch nicht zu erkennen.

Unter Code [27] "Andere kommerzielle Testsysteme" wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: HAIN Lifescience GenoType Enterococcus (8x), Roche LightCycler VRE detection Kit (2x), AmpliGnost Vancomycin A/B Resistenz differenz. von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), amplex eazyplex VRE (1x), GeneProof VRE PCR Kit (1x) und GENSPEED VanABC plus (1x).

Der Ringversuch Nr 560 „Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Das aktuelle Set enthielt zwei positive Proben (siehe Tab. 1: Anhang 1 [Anh. 1], S. 22): eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1715601; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁵ CFU/mL), eine Probe mit eine geringerer Menge (# 1715603; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁴ CFU/mL), sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1715602 und # 1715604) aber mit E. coli und einer Suspension aus humanen Zellen. Der Nachweis des Zielorganismus aus der stärker positiven Probe (# 1715601, ca. 1x10⁵ Genomkopien/mL) gelang allen 102 Teilnehmern. Probe # 1715603 mit einer zehnfach geringeren Erregermenge wurde noch von 100 der 102 Teilnehmer korrekt als „positiv“ identifiziert. Für die Teilnehmer mit falsch-negativen/fraglichen Befunden in dieser Ringversuchsrunde bleibt unser Appell unverändert bestehen, die Sensitivität der verwendeten Testsysteme zu hinterfragen, da eine Erregermenge von 1x10⁴ nicht als „äußerst gering“ einzuschätzen ist.

Bei den Proben ohne Zielorganismen (# 1715602 und # 171604), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielten, wurden im Rahmen des aktuellen Ringversuchs von jeweils einem Teilnehmer ein falsch-positives bzw. fragliches Ergebnis berichtet (Tab. 2: Anhang 1 [Anh. 1], S. 22). Dies legt ein laborinternes Kontaminationsereignis oder eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe und sollte eine sorgfältige Aufarbeitung nach sich ziehen. Andererseits sprechen die mehrheitlich richtig-negativen Ergebnisse für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen im Teilnehmerkreis. Mit einer Ausnahme wiesen alle eingesetzten Testsysteme Inhibitionskontrollen auf, eine nennenswerte Inhibition wurde von keinem der Teilnehmer berichtet. Bei den verwendeten Testsystemen lagen in-house Assays zahlenmäßig fast gleichauf mit kommerziellen Testsystemen. Unterschiede in Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit waren nicht zu erkennen.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [26] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: fast-track Diagnostics P. jirovecii (4x), Altona diagnostics RealStar P. jirovecii PCR Kit (3x), Biolegio ReadyMax Atypical pneumonia-1 Assay (2x), Genetrac P. jirovecii DNA Detection Kit (2x) und SureFast P. jirovecii PLUS (1x).

Wie gehabt möchten wir uns an dieser Stelle recht herzlich bei allen Kollegen in den zahlreichen nationalen und internationalen Sollwertlaboratorien sowie bei den Kollegen und Mitarbeitern in Jena, Salzburg, Hamburg, Oberschleißheim, Bonn, Dresden, München, Berlin, Bochum und Regensburg bedanken, die nach wie vor hochmotiviert an der praktischen Umsetzung unseres gemeinsamen Vorhabens zur externen Qualitätssicherung mitarbeiten.

Zugleich hoffen wir weiterhin auf rege Teilnahme und einen reibungslosen Ablauf der zukünftigen Ringversuchsrunden.