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GMS Zeitschrift zur Förderung der Qualitätssicherung in medizinischen Laboratorien

Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in medizinischen Laboratorien e. V. (INSTAND e. V.)

ISSN 1869-4241

Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis PCR/NAT: Auswertung des Ringversuchs Mai 2016 von INSTAND e.V. zur externen Qualitätskontrolle molekularbiologischer Nachweisverfahren in der bakteriologischen Diagnostik

Report

  • corresponding author Udo Reischl - Institut für Klinische Mikrobiologie und Hygiene, Universitätsklinikum Regensburg, Deutschland
  • Wulf Schneider - Institut für Klinische Mikrobiologie und Hygiene, Universitätsklinikum Regensburg, Deutschland
  • Martin Ehrenschwender - Institut für Klinische Mikrobiologie und Hygiene, Universitätsklinikum Regensburg, Deutschland
  • Andreas Hiergeist - Institut für Klinische Mikrobiologie und Hygiene, Universitätsklinikum Regensburg, Deutschland
  • Matthias Maaß - Labor Dr. Heidrich und Kollegen MVZ GmbH, Hamburg, Deutschland
  • Michael Baier - Institut für Medizinische Mikrobiologie, Klinikum der Friedrich-Schiller-Universität Jena, Deutschland
  • Eberhard Straube - Institut für Medizinische Mikrobiologie, Klinikum der Friedrich-Schiller-Universität Jena, Deutschland
  • Dimitrios Frangoulidis - Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München, Deutschland
  • Gregor Grass - Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München, Deutschland
  • Heiner von Buttlar - Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München, Deutschland
  • Volker Fingerle - Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim, Deutschland
  • Andreas Sing - Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim, Deutschland
  • Enno Jacobs - Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Technische Universität Dresden, Deutschland
  • Ingrid Reiter-Owona - Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Parasitologie (IMMIP), Universitätsklinikum Bonn, Deutschland
  • Agnes Anders - Nationales Referenzzentrum für Gram-negative Krankenhauserreger, Abteilung für Medizinische Mikrobiologie, Ruhr-Universität Bochum, Deutschland
  • Martin Kaase - Nationales Referenzzentrum für Gram-negative Krankenhauserreger, Abteilung für Medizinische Mikrobiologie, Ruhr-Universität Bochum, Deutschland

GMS Z Forder Qualitatssich Med Lab 2016;7:Doc03

doi: 10.3205/lab000023, urn:nbn:de:0183-lab0000232

Dieses ist die deutsche Version des Artikels.
Die englische Version finden Sie unter: http://www.egms.de/en/journals/lab/2016-7/lab000023.shtml

Veröffentlicht: 5. Juli 2016

© 2016 Reischl et al.
Dieser Artikel ist ein Open-Access-Artikel und steht unter den Lizenzbedingungen der Creative Commons Attribution 4.0 License (Namensnennung). Lizenz-Angaben siehe http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.


Zusammenfassung

Der vorliegende Beitrag liefert einen Auswertungsbericht der jüngsten Ringversuchsserie „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis PCR/NAT“. Er fasst die Zielwerte, einige Bezugsgrößen und die Gesamtbewertung der Ergebnisse aller teilnehmenden Laboratorien zusammen.

Diese hochwillkommene Versuchsreihe zur externen Qualitätskontrolle (EQAS; external quality assessment scheme) von Methoden der molekularen Diagnostik auf dem Gebiet der medizinischen Mikrobiologie wurde 2002 von der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) angestoßen und wird seither von Instand e.V., Düsseldorf, organisiert. Dieses Segment der INSTAND e.V.-Ringversuchsserie wird für diagnostische Laboratorien weltweit angeboten. Unser Ringversuchskonzept entspricht der aktuellen Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen (RiLiBÄK), Teil B3, und basiert auf zwei Validierungsrunden pro Jahr (im Frühjahr und Herbst) unter einer permanent wachsenden Abdeckung der relevanten bakteriellen und fungalen humanpathogenen Erreger. Die entsprechenden Sets von Quality Control (QC)-Proben können dabei neben negativen Proben auch einige stark-positive Proben, Proben mit klinischen Varianten oder eng mit den Zielorganismen verwandte Spezies oder klinische Isolate enthalten. Weitergehende Informationen sowie die statistisch aufgearbeiteten und dokumentierten Ergebnisse der vergangenen Runden dieser Ringversuchsserie „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ können auf der Homepage von Instand e.V. (http://www.instand-ev.de) eingesehen werden. Obwohl die bevorzugte Sprache dieser Dokumente deutsch ist, streben wir an, zumindest eine kurze Diskussion der Ergebnisse sowie die wichtigsten wissenschaftlichen Aspekte in Englisch bereitzustellen und die Tabellen zweisprachig zu gestalten.


Gesamtübersicht und Auswertung der Ringversuchsergebnisse aller Teilnehmer

Nach erfolgreicher Etablierung dieser neuen Ringversuchs-Serie wollen wir hier auch für Kolleginnen und Kollegen, die bisher noch nicht an diesen Ringversuchen teilgenommen haben, die Ergebnisse der aktuellen Ringversuche für den PCR/NAT-gestützten Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, EHEC / STEC, Borrelia burgdorferi sensu lato, Legionella pneumophila, Salmonella enterica und Listeria spp., MRSA bzw. cMRSA, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetti, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Pneumocystis jirovecii (vorm. P. carinii) und der molekularen Resistenztestung für Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae sowie die beiden vor kurzem neu ins Programm aufgenommenen Ringversuche zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von Clostridium difficile (Toxingene) und VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken) darstellen und kurz diskutieren.

Für nähere Informationen über die Zusammensetzung der Ringversuchsproben, dem Sinn und Zweck dieser neuen Möglichkeit zur externen Qualitätskontrolle im Umfeld der Nukleinsäurediagnostik sowie zu den Eckdaten unseres flexiblen Ringversuchskonzepts sei hier auf unsere initiale Veröffentlichung in der Zeitschrift „Der Mikrobiologe“ verwiesen [1] . Gerne werden wir hier auch weiterhin in regelmäßigen Abständen und in ähnlicher Form über die Ergebnislage, Auswertung und Analyse unser zukünftigen Ringversuche berichten.

Wie bei allen anderen Ringversuchen erfolgt die Anmeldung zu ausgewählten Teilen der Reihe „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ über die Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in Medizinischen Laboratorien (INSTAND e.V.), Düsseldorf (http://www.instand-ev.de). Nach Abschluss des jeweiligen Ringversuchs werden die Ergebnisse der einzelnen Teilnehmer dort zentral erfasst und anhand von individuellen Bewertungskriterien werden die schriftlichen Zertifikate erstellt. Zusätzlich stehen für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe weiterer Informationen auch im Internet unter http://www.udo-reischl.de, Unterpunkt „INSTAND-Ringversuche (PCR/NAT)“, sowie auf der Homepage von INSTAND e.V. als pdf-Files zum freien Download bereit.

Neben der Aussendung von lyophilisierten Probenmaterialien zur systematischen Abprüfung von NAT-gestützten Testsystemen für derzeit 18 unterschiedliche bakterielle und fungale Zielorganismen bzw. Pathogenitätsfaktoren gab es im Rahmen dieser Ringversuchsrunde auch wieder gewisse „Highlights“.

So wurde beispielsweise im aktuellen RV 536 Legionella pneumophila auch zwei Proben mit der Spezies Legionella longbeachae versandt, die von einigen unserer Ringversuchsteilnehmer fälschlicherweise als PCR-positiv getestet wurden.

Als weiteres „Highlight“ innerhalb der aktuellen Ringversuchsrunde wurde in einer der 4 Einzelproben des RV 539 MRSA/cMRSA eine Mischung aus einem Methicillin-empfindlichen S. aureus-Isolat (MSSA) und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies ausgesandt, das methodenbedingt bei einem Teil der aktuell eingesetzten PCR/NAT Testsysteme zu falsch-positiven MRSA Ergebnissen führte. In der mikrobiologischen Praxis wird relativ häufig die gleichzeitige Anwesenheit einer Methicillin-resistenten (also mecA-positiven) Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies und eines Methicillin-empfindlichen (also mecA-negativen) S. aureus-Isolates in dem entsprechenden Abstrichmaterial beobachtet. Obwohl bei dieser Probe, im Vergleich zu früheren Ringversuchen mit ähnlicher Probenkonstellation, diesmal erfreulicherweise eine etwas höhere Richtigkeitsquote erzielt werden konnte, bestätigt die Beobachtung von über 7% falsch-positiven MRSA-Ergebnissen erneut die Sinnhaftigkeit und auch Notwendigkeit des im Rahmen der PCR/NAT-Ringversuchsdiskussionen bereits mehrfach thematisierten begleitenden kulturellen Nachweises von MRSA.

Die Aussendung des B. anthracis Stamm Pasteur (positiv für das Virulenzplasmid pXO2 und die B. anthracis-spezifischen chromosomalen Sequenzmarker rpoB und dhp61, jedoch negativ für das lethal- und edema-factor, sowie protective antigen-(pagA)-tragende Virulenzplasmid pXO1) in einer der 4 Proben des Ringversuchs RV 542: Coxiella burnetii & B. anthracis führte diesmal zu 3 falsch-negativen Ergebnissen innerhalb der Teilnehmerschaft.

Mit der Auswahl eines etwas breiteren Spektrums von relevanten Carbapenemase Genen bestätigte sich im Rahmen des neu eingeführten Ringversuchs RV 544 Carbapenemase Gene aufs Neue die Vermutung, dass viele der derzeit verwendeten Testsysteme zur molekularen Carbapenemase Detektion noch gewisse Lücken hinsichtlich der Abdeckung von unterschiedlichen Carbapenemase Genen aufweisen. Im Umfeld der molekularen Testung von Carbapenemase Genen freuen wir uns auf die Zusammenarbeit mit Frau Dr. Agnes Anders, die als Stellvertreterin von Herrn Professor Gatermann zukünftig (in Nachfolge von Dr. Martin Kaase) die Ringversuchsaktivitäten am „Nationalen Referenzzentrum für gramnegative Krankenhauserreger“ in Bochum koordiniert.

Auch bei unseren Chlamydien-Ringversuchen haben sich personelle Änderungen ergeben: Herr Professor Eberhard Straube, eines der „Gründungsmitglieder“ unserer Bakteriengenomnachweis-PCR/NAT-Ringversuchsinitiative hat nach seiner Emeritierung nun auch seine langjährige Tätigkeit als Leiter des Konsiliarlabors für Chlamydien abgegeben und seinen langjährigen Mitarbeiter Herrn Dr. Michael Baier als Nachfolger in der Funktion des stv. Ringversuchsleiters bei den RV 530 und 531 vorgeschlagen. Nach Rücksprache mit der Direktorin des Instituts für Mikrobiologie am Universitätsklinikum Jena, Frau Professor Dr. med. Bettina Löffler, und den beteiligten Fachgesellschaften wird dieser Vorschlag seitens INSTAND e.V. gerne angenommen. Wir danken Herrn Professor Straube für die vielen tollen Ideen, u.a. das Beisteuern von besonders herausfordernden Probenmaterialien (erinnert sei an die plasmiddefekte schwedische Variante von C. trachomatis oder einige apathogenen Neisserienstämme) sowie sein unermüdliches Engagement zur Verbesserung der Qualitätssicherung im Umfeld der Chlamydiendiagnostik – und freuen uns auf eine gute und erfolgreiche Zusammenarbeit mit Herrn Dr. Baier.

Hier noch ein paar Reflexionen des Ringversuchsleiters, die er sich nach der statistischen und fachlichen Auswertung der aktuellen Ringversuchsrunde nicht verkneifen konnte: viele der seriösen Diagnostikhersteller geben sich größte Mühe bei der Testentwicklung und klinischen Evaluierung – und sind dann (zurecht) stolz auf die Leistungsdaten ihrer modernen PCR/NAT-Assays. Auffällig bei vielen der aktuellen aber auch bei einigen der früheren Ringversuche ist das unterschiedlich gute Abschneiden von Teilnehmern mit ein und demselben kommerziellen, vorkonfektionierten und teilweise auch automatisierten und/oder kartuschenartig geschlossenen Testsystemen. Die meisten dieser Assays sind zudem auch noch IVD-zertifiziert – mit allen aufwändigen herstellerseitigen Vorkehrungen zur „zuverlässigen“ Durchführung und standardisierten Ergebnisinterpretation.

Die auffällige „Streuung der Performance“ (bzw. das Auftreten einzelner Ausreißer) unterstreicht aus Sicht des Ringversuchsleiters umso mehr die Bedeutung der Qualitätsstandards, wie beispielsweise das regelmäßige Mitführen von geeigneten Extraktions-, Positiv- und Negativ-Kontrollen sowie Schulungen und kontrollierte Maßnahmen zur Vermeidung von exogenen Kontaminationsmöglichkeiten in PCR/NAT-Arbeitsbereichen, die u.a. im Rahmen der aktuellen RiLiBÄK, der Akkreditierung und der praxisorientiert verfassten MIQ-1 gefordert werden. Deren Sinnhaftigkeit und Stringenz mag aus Anwendersicht ja gelegentlich bezweifelt werden, wird aber in diesen Ringversuchsrunden (sozusagen von neutraler Warte aus) dennoch immer wieder aufs Neue bestätigt. Vielleicht lohnt es sich unter diesen Gesichtspunkten doch wieder mal ein Blick in die MIQ oder RiLiBÄK um hier und dort noch ungenutztes Potential auszuschöpfen…

Maximale diagnostische Sicherheit sollte doch unser aller Prämisse sein und das unnötige bzw. fahrlässige Generieren von falsch-negativen oder falsch-positiven Befunden (und vor allem deren Folgen für die betroffenen Patienten) sind durch keine methodischen oder ökonomischen Ausflüchte zu entschuldigen!

Also „nix für ungut“ liebe Kolleginnen und Kollegen, wie der Bayer so schön sagt ;-)

Alle Teilnehmer sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.


Untersuchungsergebnisse Mai 2016

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt.

In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit relativ geringer Menge folgender Zielorganismen: Chlamydia trachomatis (Probe # 1615301 und Probe # 1615312), Neisseria gonorrhoeae (Probe # 1615303), Helicobacter pylori (Probe # 1615333), Borrelia afzelii (Probe # 1615354), Salmonella enterica ser. enteritidis (Probe # 1615372), Mycoplasma pneumoniae (Probe # 1615413), Coxiella burnetii (Probe # 1615423), Bacillus anthracis (Probe # 1615422), sowie Pneumocystis jirovecii (Probe # 1615604).

Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze, u.a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker, für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen.

An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind, und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Mit Ausnahme der zuvor erwähnten „grenzwertig positiven“ Einzelproben wurden die Mengen der entsprechenden Zielorganismen in den Probensätzen der aktuellen Ringversuchsrunde wieder relativ deutlich über der Nachweisgrenze von „durchschnittlich sensitiven PCR/NAT-Testkonzepten“ eingestellt. Diese definieren wir wie folgt: als Richtwert für die Bewertung von Ringversuchsergebnissen gilt das 10- bis 50-fache der unteren Nachweisgrenze durchschnittlich sensitiver PCR-Protokolle unter Standardbedingungen (50 µl Block-Cycler Reaktionsansätze, 35 PCR-Zyklen, ggf. entsprechende real-time PCR Protokolle; gut evaluierte Primersequenzen).

Bei den meisten Probenmaterialien der aktuellen Ringversuchsrunde stellen falsch-negative Ergebnisse damit einen deutlichen Hinweis auf ernstzunehmende Mängel innerhalb der eingesetzten Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion, Amplifikation und Detektion dar.

Falsch-positive Ergebnisse sind dagegen in der Regel als Hinweis auf eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung und/oder auf mangelnde Spezifität der eingesetzten Testsysteme zu betrachten.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Die Tabellen 1 (Anhang 1[Anh. 1]) zeigen dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert) mit den entsprechenden Codenummern der Ergebnisbögen. Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in den Tabellen 2 (Anhang 1[Anh. 1]) nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen, und in den Tabellen 3 (Anhang 1 [Anh. 1]) nach der absoluten Anzahl der richtig positiven und richtig negativen Ergebnisse, sowie deren prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt.

Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

RV 530: Neisseria gonorrhoeae & Chlamydia trachomatis

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis- und Gonokokken-Nachweis. Trotz der relativ geringen Erregermenge in den vier unterschiedlich zusammengesetzten positiven Proben führte auch diesmal die Verfügbarkeit gut evaluierter und zum Teil automatisierter NAT-gestützter Analysesysteme für Chlamydia trachomatis zu hohen Richtigkeitsquoten sowohl für positive, als auch für negative Befunde.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt jeweils eine Probe mit ca. ~1x104 IFU/mL an C. trachomatis (# 1615301), zwei Proben mit einer ca. 10-fach höheren Menge an C. trachomatis (# 1615303 und 1615304, ~1x105 IFU/mL), eine Probe (# 1615303) mit ca. 1x103 CFU/mL an N. gonorrhoeae sowie eine Probe mit einer ca. 100-fach höheren Menge an N. gonorrhoeae Zielorganismen (# 1615301; ~5x106 CFU/mL).

Der Übersichtlichkeit halber werden wir bei diesem kombinierten Ringversuch (CT/NG) die Ergebniskonstellation zukünftig in 7 getrennten Tabellen (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1-3) darstellen. Damit wird die diagnostische Performance der jeweiligen Testsysteme beim Nachweis von CT und NG aussagekräftiger (Tabelle 4: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei CT, Tabelle 6: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei NG; jeweils gefolgt von den Richtigkeitsquoten nach aufgeführten Testsystemen in den Tabellen 5 und 7).

Auch wenn die etwas schwächer positive Probe # 1615301 des aktuellen Ringversuchs nur mit ca. 104 IFU/mL an C. trachomatis-Zielorganismen versetzt worden war, fanden sich unter den von insgesamt 216 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis diesmal erfreulicherweise keine falsch-negativen Ergebnisse. Bei den beiden ca. 10-fach stärker CT-positiven Proben # 1615303 und # 1615304 des aktuellen Probensets wurden von den 216 Teilnehmern diesmal nur insgesamt ein falsch-negatives Ergebnis mitgeteilt. Da hier von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei dem einzelnen falschen Ergebnis vermutlich um einen Ringversuchstypischen „sporadischen Ausreißer“. Der betreffende Teilnehmer führte auf seinem Ergebnisformular die Verwendung eines kommerziellen und IVD-gelabelten Testsystems an, mit dem aber viele andere Teilnehmer die C. trachomatis-Zielorganismen in dieser Probe problemlos nachweisen konnten.

Für die C. trachomatis-negative Probe # 1615302 wurde aus dem gesamten Teilnehmerfeld ebenfalls nur ein einzelnes falsch-positives Ergebnis berichtet.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-Nachweises wurden für die beiden positiven Proben # 1615301 und # 1615303 (N. gonorrhoeae; ca. 5x106 bzw. 1x103 CFU/mL) diesmal jedoch von neun der insgesamt 216 Teilnehmer ein falsch-negatives Ergebnisse für Gonokokken DNA bei der schwach positiven Probe mitgeteilt. Erfreulicherweise wurde die relativ hoch positive Probe # 1615301 von allen Teilnehmern korrekt positiv befundet.

Bei den beiden GO-negativen Proben wurden jedoch von 8 bzw. 2 Teilnehmern falsch-positive Ergebnisse berichtet. Dieser im Vergleich zu früheren Ringversuchsrunden doch überraschend hohe Anteil an falsch-positiven Ergebnissen deutet auf Kontaminationsereignisse oder wie auch immer geartete Template-Nukleinsäure Verschleppungen bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung hin. Vor allem weil im aktuellen 4er-Set die GO-negative Probe # 1615302 (mit den 8 falsch-positiven Ergebnissen) bei sequentieller Abarbeitung unmittelbar auf die stark GO-positive Probe # 1615301 folgt. Den betroffenen Laboratorien sollten diese Ergebnisse Anlass geben, ihren individuellen diagnostischen Workflow hinsichtlich der Kontaminationssicherheit während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik zu überprüfen und gegebenenfalls zu optimieren.

Angesichts der mit 1x105 IFU/mL ehrlicherweise nicht als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen in der CT-positiven Probe # 1615303 sowie 1x103 CFU/mL an Zielorganismen in der GO-positiven Probe # 1615303 sollten falsch-negative Ergebnisse bei betroffenen Ringversuchsteilnehmern ebenfalls Anlass zur Optimierung ihrer jeweiligen spezifischen NAT-gestützten Testsysteme geben.

Da die beobachteten „Sensitivitätsprobleme“ diesmal nur äußerst marginal ausfallen, sich offensichtlich nicht auf bestimmte Testkonzepte eingrenzen lassen und sporadisch durch das ganze Portfolio der eingesetzten Testsysteme gehen, kann dem großen Rest des Teilnehmerfeldes erneut eine erfreulich gute analytische Sensitivität und Spezifität ihrer CT- und GO-spezifischen NAT-Testsysteme, sowie der angewandten Prozeduren zur Probenaufarbeitung und -prozessierung attestiert werden.

Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen bleibt es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit den betroffenen Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung, als auf intrinsische Unzulänglichkeiten, der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Ich glaube, es ist auch für den Leser dieser Ringversuchsdiskussion weitgehend nachvollziehbar, dass wir als Organisatoren von Testkonzept- und Testplattform-übergreifenden Ringversuchen bei der Konfektionierung unserer Probenmaterialien leider nicht jede Besonderheit im Abarbeitungsprotokoll von kommerziellen Testsystemen berücksichtigen oder unterschiedliche Arten von Ringversuchsprobenmaterial für bestimmte Testsysteme bereitstellen können.

Auf diesen Umstand wurde bereits bei früheren Ringversuchen mehrfach im Zusammenhang mit den RNA-Zielsequenzen der AMPLIFIED CT Testkits oder der APTIMA COMBO 2 Testkits (Hersteller: Gen-Probe Inc.) hingewiesen. Werden von Teilnehmern bestimmte NAT-Testsysteme eingesetzt, die erregerspezifische RNA-Zielsequenzen nachweisen oder auf einem RNA-basierten Amplifikationsprozess (TMA; Transcription-Mediated Amplification, o.ä.) beruhen, so kann mit dem hier versandten Probenmaterial offiziell keine regelgerechte Abprüfung der entsprechenden Sensitivitäten unter Routinebedingungen gewährleistet werden. Aber selbst wenn das Herstellungsverfahren unserer Ringversuchsproben primär nicht auf die Stabilisierung von RNA-Molekülen hin optimiert und getestet wurde, so konnten dennoch sowohl bei der aktuellen, wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchsrunden, von vielen Teilnehmern mit RNA-gestützten Testsystemen hohe Richtigkeitsquoten erzielt werden. Aktuell wurden die C. trachomatis-Zielorganismen von allen 10 Teilnehmern mit RNA-basierten Gen-Probe-Testsystemen in beiden positiven Proben erfolgreich nachgewiesen. Auch in der relativ stark GO-positiven Probe # 1615303 gelang allen Teilnehmern mit RNA-basierten Gen-Probe-Testsystemen der erfolgreiche Nachweis der Neisseria gonorrhoeae-Zielorganismen. Nur bei der sehr schwach GO-positiven Probe # 1615303 (in der zusätzlich noch relativ hohe Mengen an C. trachomatis enthalten war) versagte der Nachweis bei 9 der insgesamt 10 Teilnehmer mit RNA-basierten Gen-Probe-Testsystemen. Da bei der Erteilung der Zertifikate ja bekanntermaßen ein falsches Ergebnis innerhalb der 4 bewerteten Ergebnisse toleriert wird, werden auch diesmal allen 10 Teilnehmern die entsprechenden Zertifikate erteilt.

Entsprechende Inhibitionskontrollen wurden von 215 der insgesamt 216 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt.

Bei den ermittelten Richtigkeitsquoten für Teilnehmer mit dem Roche COBAS Amplicor, COBAS TaqMan, dem Becton Dickinson ProbeTec, Abbott RealTime CT/NG, Artus CT, LightMix CT/NG oder anderen Testsystemen muss berücksichtigt werden, dass im Rahmen dieser Ringversuchsauswertung in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 1) nicht zwischen dem spezifischen Nachweis von Chlamydien und Gonokokken differenziert wurde. Mit dem Großteil dieser kombinierten Testsysteme wurden insgesamt erfreulich hohe Richtigkeitsquoten sowohl für die positiven als auch für die negativen Ergebnisse beobachtet. Um diesmal und auch zukünftig eine detaillierte Bewertung der C. trachomatis- und GO-spezifischen NAT-Komponenten dieser kombinierten Testsysteme zu ermöglichen, haben wir zusätzlich die Tabellen 4 bis 7 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2-3) angefertigt. In den Tabellen 4 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 2) sind dabei nur die C. trachomatis (CT)-spezifischen Ergebnisse und in den Tabellen 6 und 7 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 3) nur die Neisseria gonorrhoeae (GO)-spezifischen Ergebnisse dargestellt und statistisch ausgewertet.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“ bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Im handschriftlichen Kommentarfeld der Ergebnisformulare wurden unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience FluoroType CT (12x), HAIN Lifescience FluoroType NG (11x), HAIN Lifescience GenoQuick CT (2x), BD Max CT/GC/TV assay (7x), Seegene Anyplex™ II STI-7 Detection (5x), GeneProof N. gonorrhoeae PCR Kit (5x), GeneProof C. trachomatis PCR Kit (3x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (4x), Urethritis basic von fast-track Diagnostics (3x), Mikrogen Diagenode N. gonorrhoeae Real Time PCR kit (3x), Mikrogen Diagenode C. trachomatis Real Time PCR kit (2x), Amplex Hyplex STD Chlamydia und Neisseria (2x), Sacace Biotechnologies N. gonorrhoeae Real-TM (2x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis Real-TM (2x), AmpliSens C. trachomatis und N. gonorrhoeae (2x), Bioron RealLine C. trachomatis/ N. gonorrhoeae (1x), QIAGEN artus CT/GC QS-RGQ Kit (1x), Aptima Combo 2 assay CT/GC (1x), N. gonorrhoeae Amplex Multiplex PCR-ELISA (1x), Medac/Goffin CT/NG Assay (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID STD Kit (1x), operon CT Oligogen (1x), operon NG Oligogen (1x), Liferiver C. trachomatis Real Time PCR Kit (1x) und Liferiver N. gonorrhoeae Real Time PCR Kit (1x).

Unabhängig von der Art des verwendeten Testsystems soll in diesem Zusammenhang auch noch einmal darauf hingewiesen werden, dass in Gegenwart von relativ hohen Mengen an Zielorganismen (bzw. deren Nukleinsäure) die interne Kontrollreaktion aufgrund der „Konkurrenzsituation“ mit der Amplifikation der eigentlichen Zielsequenz durchaus negativ ausfallen kann, obwohl keine Inhibition der PCR-Reaktion im eigentlichen Sinne vorliegt.

Bei kombinierten Testsystemen (Stichwort: Multiplex-PCR) kann ja bekanntlich auch die Gegenwart des einen Erregers oder Zielorganismus in hoher Menge die Nachweisempfindlichkeit für den gleichzeitigen Nachweis des/der anderen Erreger oder Zielorganismen im Multiplex-Reaktionsansatz negativ beeinflussen. Bei bestimmten suboptimal abgestimmten PCR/NAT-Testsystemen könnte die Zusammensetzung der Probe # 1615303 des aktuellen Ringversuchs eine solche Problemkonstellation repräsentieren und in der Konsequenz die etwas schlechteren Richtigkeitsquoten für den Gonokokken-DNA-Nachweis erklären.

RV 531: Chlamydia trachomatis

Das Probenset des aktuellen Ringversuchs enthielt diesmal eine Probe mit ca. 1x104 IFU/mL an C. trachomatis (# 1615312), zwei Proben mit ca. 1x105 IFU/mL an C. trachomatis (# 1615311 und # 1615314), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1615313), die ausschließlich nicht infizierte Zellen und Escherichia coli enthielt.

Wie Tab. 2 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 4) der statistischen Auswertung zu entnehmen ist, wurden von den insgesamt 95 Teilnehmern bei der negativen Probe # 1525313 sowie bei zwei der drei positiven Proben (# 1525311 und # 1525314) diesmal durchwegs korrekte Ergebnisse mitgeteilt. Bei der dritten positiven Probe # 1525312, die im Vergleich zu den anderen beiden positiven Proben ca. zehnmal weniger C. trachomatis enthielt, wurde lediglich von einem der 95 Teilnehmer ein falsch-negatives Resultat beobachtet. Die markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und hervorragenden Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis-Zielorganismen kann erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme sowie der aktuellen Kits und automatisierten Testplattformen zur Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Prozessierung angesehen werden.

Auch wenn mit ca. 1x104 IFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme noch nicht erreicht oder unterschritten sein sollte, sollten bei Ringversuchsteilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität generell sowohl falsch-negative, als auch falsch-positive Ergebnisse Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Angesichts der nach wie vor anhaltenden Diskussion um das „Pooling“ von entsprechendem Untersuchungsmaterial bleibt der Aspekt der analytischen Sensitivität der jeweils eingesetzten Testsysteme bedeutsam.

Inhibitionskontrollen wurden von 94 der insgesamt 95 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben. Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten in-house-Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf erfreulich hohem Niveau.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. folgende Testsysteme aufgeführt: GeneProof C. trachomatis PCR Kit (5x), HAIN Lifescience GenoQuick CT (5x), BD Max CT/GC/TV assay (4x), Sacace Biotechnologies C. trachomatis Real-TM (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID STD Kit (1x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (1x), AmpliGnost C. trachomatis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x) und Genetrac DK-CHT C. trachomatis DNA Detection Kit (1x).

RV 532: Bordetella pertussis

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal zwei identische Proben mit einer relativ hohen Menge an Zielorganismen (# 1615321 und # 1615324; B. pertussis, ~1x105 CFU/ml), sowie eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella holmesii als verwandte Spezies (# 1615322 mit 1x106 CFU/mL). Die Probe # 1615323 enthielt diesmal keine Zielorganismen, sondern lediglich E. coli und eine Suspension aus humanem Zellmaterial.

Die Verfügbarkeit von offensichtlich inzwischen sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemen für den Nachweis von Bordetella pertussis-DNA führte diesmal sowohl bei den positiven als auch bei den negativen Proben zu relativ hohen Richtigkeitsquoten.

Wie schon im letzten Ringversuch bereitete der spezifische Nachweis von Bordetella pertussis-DNA in den beiden positiven Proben # 1615321 und 1615324 den insgesamt 152 Teilnehmern keine allzu großen Schwierigkeiten. Während bei der Probe # 1615321 mit einer Erregermenge von ~1x105 CFU/mL durchwegs richtig-positive Ergebnisse berichtet wurden, befanden sich unter den PCR/NAT-Ergebnissen für die (eigentlich identische) Probe # 1615324 interessanterweise jedoch zwei falsch-negative Resultate. Ohne den beiden betroffenen Teilnehmern, die mit ihren kommerziellen PCR/NAT-Testsystemen die B. pertussis-Zielorganismen in der zweiten positiven Probe offenbar nicht nachweisen konnten, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in solchen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung als auf intrinsische Unzulänglichkeiten der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Im RV 532 befand sich diesmal wieder ein IS481-positives Bordetella holmesii-Isolat, das (Methoden- bzw. Zielsequenz-bedingt) mit einigen B. pertussis-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen kreuzreagierte. Die Aktualität dieser Problematik spiegelt sich beispielsweise in einer Veröffentlichung französischer Kollegen wider [2].

Insgesamt betrachtet scheint aber der Vorteil einer hochsensitiven Detektion von B. pertussis und B. holmesii über die Verwendung der repetitiven IS481-Zielsequenz die Nachteile einer (eher aus akademischer Sicht wünschenswerten) Differenzierungsmöglichkeit zwischen den beiden Spezies in der PCR-Routinediagnostik mehr als aufzuwiegen. Zudem scheint in unseren Breiten B. holmesii eher selten aufzutreten (siehe [3]) und Infektionen mit beiden Spezies scheinen eine gleichermaßen „behandlungsbedürftige“ Symptomatik hervorzurufen. Eine Abgrenzung zu den übrigen (IS481-negativen) Bordetella-Spezies muss jedoch aus diagnostischer Sicht stets gewährleistet sein (siehe Ringversuchsdiskussion April 2011 [4]).

Angesichts der sehr hohen Richtigkeitsquoten für die beiden B. pertussis-positiven Proben # 1615321 und # 1615324 und der technisch bzw. methodisch bei der Verwendung der IS481-Zielsequenz zu erwartenden Kreuzreaktion mit B. holmesii in Probe # 1615322 hat sich der Ringversuchsleiter (in enger Abstimmung mit dem Sollwertlabor) dazu entschlossen, bei der Erteilung der Zertifikate die falsch-positiven Ergebnisse bei B. holmesii nicht als falsch-negativ zu bewerten.

Der eine Teilnehmer mit falsch-positivem Ergebnis bei der E. coli-positiven Probe # 1615323 sollte jedoch intensiv daran arbeiten, die analytische Spezifität seiner jeweiligen Testsysteme zu verbessern.

Inhibitionskontrollen wurden von 150 der insgesamt 152 Teilnehmer durchgeführt und Inhibitionsereignisse wurden bei dem aktuellen Probenset bei keinem der Teilnehmer innerhalb der jeweils ausgesandten vier Einzelproben beobachtet.

Wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchen verwendete ungefähr die Hälfte der Teilnehmer (n=63) selbstentwickelte (in house) Testsysteme oder auf dem Ergebnisformular nicht näher spezifizierte kommerzielle Testkits (n=5) mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von B. pertussis. In diesem Zusammenhang wurde von 43 Teilnehmern explizit die Verwendung der Insertionssequenz IS481, von 6 Teilnehmern die Verwendung des Pertussis-Toxin-Gens und von 2 Teilnehmern die Verwendung eines ribosomalen Gens als B. pertussis-spezifische Zielsequenz angegeben.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: GeneProof B. pertussis/parapertussis PCR Kit (9x), Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP B. pertussis (7x), Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bacterial Kit (1x), AmpliGnost B. pertussis/parapertussis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (5x), Bio-Evolution real time PCR kit B. pertussis/parapertussis (2x), Attomol Bordetella Realtime LT (2x), Seegene Anyplex II RB5 Detection (2x), Seegene Seeplex PneumoBacter ACE Detection (1x), ARGENE Bordetella R-gene (1x), fast-track Diagnostics Bordetella (1x), Meridian Bioscience illumigene Pertussis (1x), AmpliSens Bordetella multi FRT PCR Kit (1x), Labsystems Diagnostics B. pertussis + B. parapertussis Duplex Real-Time PCR (1x), Ingenetix Bacto Real B. pertussis/B. parapertussis (2x), Altona diagnostic RealStar Bordetella PCR Kit (1x), DYNEX Real Time PCR PneumoPlex (1x) und Qiagen RespiFinder RG Panel (1x).

RV 533: Helicobacter pylori

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 6) dargestellt, enthielt Probe # 1615331 des aktuellen Ringversuchs eine relativ hohe Menge an Clarithromycin-sensiblen H. pylori (~105 Organismen/mL). Die Probe # 1615333 enthielt das gleiche Isolat in einer etwa hundertfach geringeren Menge (~103 CFU/mL). Probe # 1615332 enthielt eine Kultursuspension der mit dem Zielorganismus verwandten Spezies Helicobacter felis (~ 1x103 CFU/ml) und Probe # 1615334 enthielt ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Erfreulicherweise wurden sowohl die etwas stärker positive H. pylori-Probe # 1615331 und die H. pylori-negative Probe 1615334 von allen der insgesamt 48 Teilnehmer ausnahmslos als richtig-positiv bzw. -negativ bewertet. Die Probe #1615334 enthielt diesmal eine relativ geringe Menge an Helicobacter pylori-Zielorganismen und wurde insgesamt von 2 Teilnehmern als falsch-negativ befundet.

In der aktuellen Ringversuchsrunde wurde zudem die analytische Spezifität der verwendeten Testsysteme durch die Probe # 1615332 überprüft, welche mit Helicobacter felis eine „non-pylori“ Helicobacter-Spezies enthielt. Für diese Probe wurden diesmal 5 falsch-positive Ergebnisse sowie ein fragliches Ergebnis berichtet. Falsch-positive H. pylori-Ergebnisse bei dieser Probe sollten jedoch zum Anlass genommen werden, die Speziesspezifität des verwendeten PCR/NAT-Testsystems zu überprüfen. Möglicherweise lag hier bei dem einen oder anderen Teilnehmer aber auch ein laborinternes Kontaminationsereignis mit Template-DNA oder Verschleppung von Probenmaterial aus der relativ stark H. pylori-positiven Probe # 1615331 zugrunde, was ebenfalls eine Überprüfung der Arbeitsabläufe und ggfs. auch des verwendeten Testsystems nach sich ziehen sollte.

Inhibitionskontrollen wurden von allen der insgesamt 48 Teilnehmer durchgeführt, Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet.

Sowohl die kommerziellen, als auch die eigenentwickelten Testsysteme schnitten im aktuellen Ringversuch wieder einmal erfreulich gut ab. So erreichten die in-house Testsysteme wie auch die kommerziellen Assays sehr hohe Richtigkeitsquoten was die richtig-positiven Ergebnisse betrifft. Auch bei den richtig-negativen Ergebnissen waren keine signifikanten Unterschiede in den Richtigkeitsquoten von in-house Testsystemen und kommerziellen Assays auszumachen.

Bis auf 10 Teilnehmer mit kommerziellen Testsystemen (im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ 6x RIDAGENE Helicobacter pylori von r-Biopharm und 1x H. pylori Real TM von Sacace Biotechnologies angegeben) verwendeten ungefähr die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte, sog. in-house Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von H. pylori.

Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori-Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen, innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs, mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 40 der insgesamt 48 Teilnehmer mitgeteilt, und mit Ausnahme von 3 Ergebnissen waren die mitgeteilten Ergebnisse der molekularen Resistenztestung auch durchweg korrekt.

RV 534: EHEC/STEC

Wie auch bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr in dem Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Genen und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher zwei unterschiedliche, aber relativ stark EHEC-positive Proben: mit ca. 5x104 CFU/mL (# 1615344: E. coli, stx2c-, eae-, hlyA- und O26:H11-positiv) und mit ca. 5x105 CFU/mL (# 1615342: E. coli, stx1-, stx2-, eae-, hlyA- und O157-positiv) sowie eine Probe mit 5x104 CFU/ml eines EPEC-Isolats (# 1615341, eae-positiv) und eine Probe mit 5x104 CFU/ml eines EIEC-Isolats (# 1615343).

In diesem Ringversuch waren keine „exotischen“ Shiga-Toxin-Gene vertreten, sodass, begründet auf die Verfügbarkeit von mittlerweile bestens etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC, bei allen Proben durchwegs hohe Richtigkeitsquoten – sowohl für positive, als auch für negative Befunde – verzeichnet werden konnten.

Die beiden EHEC-positiven Proben # 1615342 bzw. # 1615344 wurden jeweils von 124 der insgesamt 125 Teilnehmer als richtig-positiv berichtet. Eine naheliegende Erklärung für die einzelnen falsch-negativen Ergebnisse bei der stx1-, stx2-, hly- und eae-positiven Probe # 1615342 und der stx2c-, hly- und eae-positiven Probe # 1615344 gibt es aus Sicht der Ringversuchsauswertung nicht.

Sowohl das EPEC-Isolat in Probe # 1615341 (E. coli, eae-positiv, hlyA-negativ) als auch das EIEC-Isolat in Probe # 1615343 wurde jeweils von 123 der insgesamt 125 Teilnehmer korrekterweise als negativ befundet. Von zwei Teilnehmern wurde hier jedoch ein positives PCR-Ergebnis für EHEC berichtet. Bei genauerer (visueller) Prüfung der jeweiligen Ergebnisbögen, der handschriftlichen Kommentare sowie der angegebenen Code-Nummern war aber in ersterem Fall rasch klar, dass es sich hier offenbar um einen positiven PCR-Nachweis des eae-Gens (bei negativem PCR-Nachweis der stx-Gene) handelte. Daher haben wir diese auf dem Ergebnisformular präzise spezifizierten Ergebnisse bei der Bewertung zur Erteilung der Zertifikate methodisch und fachlich korrekt als „EPEC-positiv“ aber „EHEC-negativ“ umklassifiziert. Die beiden falsch-positiven EHEC-Ergebnisse bei der EIEC-positiven Probe # 1615343 konnten wir auch nach Durchsicht der entsprechenden Ergebnisbögen nicht genauer auflösen.

Wie bereits in den vorhergegangenen Ringversuchsrunden zu beobachten, führt die Verfügbarkeit von mittlerweile bestens etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC hier durchwegs zu hohen Richtigkeitsquoten – sowohl für positive als auch für negative Befunde. Zudem waren in der aktuellen Runde des EHEC-PCR-Ringversuchs auch keine Isolate mit „exotischen“ Varianten der Shiga-Toxin-Gene vertreten.

Die beiden EHEC-positiven Proben # 1615342 bzw. # 1615344 wurden problemlos von nahezu allen der insgesamt 125 Teilnehmer auch als solche erkannt und im Ergebnisformular als richtig-positiv berichtet. Die wenigen Teilnehmer mit falsch-negativem Ergebnis für die positive EHEC-Probe verwenden vermutlich Testsysteme mit geringerer analytischer Sensitivität oder verlieren etwas Sensitivität beim Aufschluss des Probenmaterials. Insgesamt gesehen sollte das aber nicht weiter schlimm sein, da in den meisten der teilnehmenden Laboratorien ein NAT-gestützter Nachweis von Shiga-Toxin-Genen im Umfeld der EHEC-Diagnostik primär als Kulturbestätigungstest eingesetzt wird. Bei zukünftigen Ringversuchen werden wir uns bemühen, dass die meisten der positiven Proben wieder relativ hohe Mengen an Zielorganismen enthalten und der Schwerpunkt somit auf einer Abprüfung der analytischen Spezifität der eingesetzten Testsysteme liegt und weniger auf der dabei erzielten unteren Nachweisgrenze.

Neben in-house Testsystemen werden zunehmend vorkonfektionierte kommerzielle Assays eingesetzt. In den Richtigkeitsquoten zeigte sich keine Über- bzw. Unterlegenheit eines Systems, was für die breite Etablierung PCR-/NAT-gestützter Testsysteme spricht. Inhibitionskontrollen wurden von 123 der 125 Teilnehmer durchgeführt, Inhibitionsereignisse wurden in keinem Fall beobachtet.

Zudem wurden von 112 Teilnehmern die Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin-Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin- (eae) und/oder Enterohämolysin (hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest in dem mitgeteilten Umfang, großteils korrekt. Lediglich ein Teilnehmer berichtete hier falsche Ergebnisse.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Altona diagnostic RealStar EHEC PCR Kit (3x), BD Max Enteric Bacterial Panel (3x), TIB Molbiol LightMix modular stx-1/stx-2/eae (2x), Sacace Biotechnologies EHEC Real-TM (1x), AmpliGnost Verotoxin 1/2 (Differenzierung) PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), fast-track Diagnostics (1x) und SureFood pathogen STEC screening PLUS von Congen (1x).

RV 535: Borrelia burgdorferi

Nachdem die Probenauswahl des letzten Ringversuchs mehr auf die analytische Spezifität der eingesetzten Testsysteme abzielte, wollten wir uns im aktuellen Ringversuch wieder einmal auf die Prüfung der analytischen Sensitivität fokussieren.

Aus diesem Grund enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben eine Probe mit einer hohen Menge an Borrelia afzelii (# 1615353, ~1x105 Organismen/mL), eine Probe mit einer etwa zehnfach geringeren Menge (# 1615351, ~1x104 Organismen/mL), eine Probe mit einer etwa hundertfach geringen Menge (# 1615354, ~1x103 Organismen/mL) an Borrelia afzelii sowie eine Probe ohne Zielorganismen, die jedoch mit einer relativ hohen Menge Treponema phagedenis enthielt (# 1615352, ~1x105 Organismen/mL).

Eine kurze Rekapitulation zu B. burgdorferi sensu lato: Mittlerweile sind mehr als 20 dem B. burgdorferi sensu lato-Komplex zugehörige, genetisch eindeutig unterscheidbare „Genospezies“ beschrieben. Die zum Teil erhebliche Heterogenität selbst innerhalb einer Spezies – z.B. B. garinii – stellt hohe Anforderungen an den PCR-/NAT-gestützten B. burgdorferi-Nachweis. Die in diesem Ringversuch eingesetzte Spezies B. afzelii findet sich häufig in Zecken und ist die häufigste Spezies, die bei Hautmanifestationen nachgewiesen wird: etwa 80% der Nachweise bei Acrodermatitis chronica atrophicans sind B. afzelii. Ebenfalls gesichert humanpathogen und weit in Europa verbreitet sind B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. bavariensis und B. spielmanii, letztere bislang nur selten bei Erkrankungen (insbesondere Haut) oder in Zecken nachgewiesen. Als möglicherweise humanpathogen werden B. bissettiae, B. lusitaniae und B. valaisiana eingestuft, alle in Europa nachgewiesen. Eine weitere humanpathogene Spezies, vorläufig als Candidatus B. mayonii benannt, wurde in 2016 erstmals beschrieben: Vorkommen bislang nur in den USA bekannt und als bisher einzige B. burgdorferii s.l. Spezies zuverlässig im Blut betroffener Patienten nachweisbar. Nach dieser knappen Auffrischung zu den Ringversuchsergebnissen:

Die Detektion von Borrelia afzelii-DNA in den Proben mit hoher Erregerlast (#1615353 mit ca. 1x105 Organismen/mL und # 1615351 mit ca. 1x104 Organismen/mL) bereitete lediglich einem der Teilnehmer Probleme, sodass hier erfreulicherweise eine Quote richtig-positiver Ergebnisse von nahezu 100% erreicht wurde.

Bei abnehmender Erregerlast wurde bei der Probe # 1615354 mit ca. 1x103 Organismen/mL von drei der insgesamt 121 Teilnehmer ein falsch-negatives Ergebnis berichtet. Ein Teilnehmer klassifizierte sein Ergebnis bei der schwach positiven Probe # 1615354 als „fraglich“.

Drei Teilnehmer beobachteten mit ihren Borrelien-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen ein positives Ergebnis bei der negativen Probe # 1615352. Da diese Probe lediglich relativ hohe Mengen der verwandten Spirochäte Treponema phagedenis enthielt, ist eine Kreuzreaktion aufgrund mangelnder Spezifität des entsprechenden Testsystems bei dieser Konstellation sehr wahrscheinlich. Laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung sind natürlich ebenfalls möglich und sollten ggf. kontrolliert und korrigiert werden. Interne oder externe Inhibitionskontrollen wurden von 120 der 121 Teilnehmer mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse der PCR-Reaktion wurden im Rahmen dieser Ringversuchsrunde von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie bei den vorhergehenden Ringversuchsrunden haben auch diesmal wieder ungefähr knapp die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von Borrelien-DNA verwendet, kommerzielle Testsysteme wurden von 71 der 121 Teilnehmer eingesetzt.

Im Großen und Ganzen waren im Rahmen dieses Ringversuchs auch keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen (Sensitivität zwischen 99 und 100%) und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen (durchschnittliche Sensitivität ca. 97%) zu beobachten. Dennoch kann angemerkt werden, dass von den drei Teilnehmern, die ein falsch-negatives Ergebnis für die Probe # 1615354 mit relativ geringer Erregerlast berichteten, zwei davon durch in-house Testsysteme generiert wurden. Gegebenenfalls sollte also die Sensitivität der hauseigenen Testsysteme überprüft werden.

Darüber hinaus wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: GeneProof Borrelia burgdorferi PCR Kit (12x), HAIN Lifescience FluoroType Borrelia (3x), BIORON RealLine Borrelien Kit (3x), EliGene Borrelia RT von Elisabeth Pharmacon (3x), Autoimmun Diagnostika GenID Zecken Screening Kit (2x), BactoReal B. burgdorferi von Ingenetix (2x), Attomol B. burgdorferi Realtime LT (2x), AmpliGnost B. burgdorferi von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x) und DYNEX Real Time PCR B. burgdorferi (1x).

RV 536: Legionella pneumophila

Wie schon beim letzten Mal hier vorab nochmals der Hinweis: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Er ist daher NICHT für die Abprüfung von immunologischen Direktnachweisverfahren wie L. pneumophila SG1 Urin-Antigen Testen o.ä. geeignet. Einzelne Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets können daher typischerweise auch relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von L. pneumophila-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal nur eine Legionella pneumophila-positive Probe # 1615361, die mit einer Menge von ca. 105 CFU/mL an L. pneumophila-Serogruppe 1 versetzt war. Die Probe # 1615364 des aktuellen Sets enthielt ca. 105 CFU/mL an Legionella longbeachae und Probe # 1615363 enthielt eine ca. zehnfach geringerer Menge an L. longbeachae (104 CFU/mL) Die dritte für den entsprechenden Zielorganismus „negative“ Probe # 1615362 des aktuellen Probensets enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich E. coli.

Die relativ stark positive Probe # 1615361 mit ca. 105 CFU/mL an Legionella pneumophila SG2 wurde dabei von allen 117 Teilnehmern korrekterweise als positiv befundet.

Auch die „richtig negative“ Probe # 1615362 (nur E. coli) wurde noch von 114 der insgesamt 117 Teilnehmer als negativ für Legionella pneumophila-DNA befundet. Drei Teilnehmer berichteten bei dieser Probe jedoch ein falsch-positives Ergebnis für L. pneumophila. Die betroffenen Laboratorien sollten mögliche laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während ihrer individuellen Probenextraktion und -abarbeitung ggf. kontrollieren und bestmöglich korrigieren.

Die beiden mit relativ hohen Mengen an Legionella longbeachae (~1x105 bzw. ~1x104 CFU/mL) versetzten Proben wurden von 109 der insgesamt 117 Teilnehmer mit ihren L. pneumophila-spezifischen PCR-/NAT-Testsystemen korrekt als negativ befundet. Jeweils 8 Teilnehmer berichteten bei beiden Proben ein falsch-positives Ergebnis für L. pneumophila-DNA, was auf eine Kreuzreaktion bzw. mangelnde Speziesspezifität der Zielsequenz zurückzuführen sein dürfte. Vor allem in-house real-time PCR-Protokolle mit ribosomalen Zielsequenzen zeigten in der Vergangenheit immer wieder Probleme bei der Speziesspezifität. Bei Verwendung von nested Block-Cycler PCR-Protokollen zur Amplifikation von spezifischen Bereichen der 16S rDNA und optionaler DNA-Sequenzierung sollte jedoch der Fehler eher auf Anwenderseite gesucht werden (beispielsweise Kontaminationsereignisse bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung), da dieses Testkonzept in jedem Fall die Unterscheidung zwischen Legionella longbeachae und Legionella pneumophila erlauben sollte.

Inhibitionskontrollen wurden von 115 der 117 Teilnehmer durchgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden offenbar nicht beobachtet.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 75 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila-DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Signifikante Unterschiede bezüglich der analytischen Sensitivität zwischen kommerziellen und selbstentwickelten Testsystemen (von 44 Teilnehmern verwendet) fanden sich nicht.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 43 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila-DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bacterial Kit (10x), AmpliGnost L. pneumophila von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (6x), Mikrogen Diagenode Lpn-050 Kit (6x), r-Biopharm RIDAGENE Legionella (4x), r-Biopharm SureFast L. pneumophila PLUS (2x), Seegene Seeplex PneumoBacter ACE detection (3x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (2x), ARGENE Legio pneumo/Cc r-gene (2x), Euroclone Duplica Real Time L. pneumophila Detection Kit (2x), Ingenetix Bacto Real L. pneumophila (2x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 33 (1x), Seegene Anyplex II RB5 Detection (1x) und DYNEX Real Time PCR PneumoPlex (1x).

RV 537: Salmonella enterica

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal drei positive Proben. Eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1615371; Salmonella enterica ser. enteritidis, ~1x106 CFU/mL), eine mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1615373; Salmonella enterica ser. tennessee ~1x105 CFU/mL) und Probe # 1615372 mit Salmonella enterica ser. enteritidis; ~5x104 CFU/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1615374), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte diesmal bei 3 der 4 Proben des Ringversuchssets zu sehr hohen Richtigkeitsquoten. Bezüglich der analytischen Sensitivität wurde es erst bei Probe # 1615372 (~5x104 CFU/mL) „interessant“. Nur mehr 17 der insgesamt 25 Teilnehmer berichteten hier ein positives Ergebnis für den erfolgreichen Nachweis von Salmonella enterica-DNA. Auch in vorausgegangenen Ringversuchen waren bei relativ niedrigen Erregerlasten immer wieder falsch-negative Ergebnisse berichtet worden, was im Einzelfall eine etwas eingehendere Überprüfung der individuell etablierten PCR/NAT-Testsysteme nach sich ziehen sollte.

Da in der aktuellen Ringversuchsrunde keine falsch-positiven Befunde für „negative“ Proben mitgeteilt wurden, deutet dies, im Vergleich zu manchen der vorhergehenden Ringversuchsrunden, auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Inhibitionskontrollen wurden von allen 25 Teilnehmern durchgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden im aktuellen Probensatz für keine der 4 Einzelproben berichtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ von einem Teilnehmer die Verwendung des folgenden Kits aufgeführt: r-biopharm RIDAGENE Bacterial Stool Panel (4x), Congen SureFood pathogen Salmonella PLUS (3x), BD Max Enteric Panel (2x), fast-track Diagnostics (2x) und Mikrogen Diagenode Gastroenteritis Bacteria Panel (1x).

RV 538: Listeria spp.

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken. Daher werden, wie in dieser Ringversuchsrunde, auch andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe zu finden sein. So wie im Fall der Probe # 1615381, die diesmal relativ hohe Mengen an L. innocua enthielt. Proben # 1615382 und # 1615384 enthielten eine relativ hohe Menge an L. monocytogenes (ca. 1x105 CFU/mL), die von allen der insgesamt 39 Teilnehmer korrekt erfasst wurden. Erfreulicherweise wurde auch die Probe # 1615383, welche ausschließlich E. coli enthielt, von allen Laboratorien als „negativ“ befundet, was für eine sehr gute Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden Laboratorien spricht.

Da von allen Teilnehmern die ausschließliche Verwendung von L. monocytogenes-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen angegeben wurde, sind die durchwegs negativen Ergebnisse bei Probe # 1615381 (L. innocua, ca. 105 CFU/mL) nicht verwunderlich oder als falsch-negativ für den eigentlichen Zielorganismus „Listeria spp.“ dieses Ringversuchs zu bewerten. Im Umkehrschluss spricht diese Datenlage für eine erfreulich hohe Spezifität der eingesetzten L. monocytogenes-spezifischen Testsysteme. Bei diesem Ringversuch besteht nämlich explizit die Option einer differenzierten Befundmitteilung: hält ein Teilnehmer lediglich ein L. monocytogenes-spezifisches NAT-Verfahren vor, so kann er dies über den Zusatzcode [71] im Ergebnisfeld angeben, und für die Erstellung des individuellen Zertifikats seitens INSTAND e.V. werden dann auch nur die L. monocytogenes-spezifischen Ergebnisse zur Bewertung herangezogen.

Von allen 39 Teilnehmern wurden Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen verwendet. Vermeintliche Inhibitionsereignisse bei der Aufarbeitung und Analyse der Ringversuchsproben wurden nicht beobachtet.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Sacace Biotechnologies L. monocytogenes Real-TM (2x), DYNEX Real Time PCR MeningoPlex (1x), r-Biopharm SureFast L.monocytogenes PLUS (1x), Diarella Listeria real time PCR Kit TM von Gerbion (1x), Liferiver L. monocytogenes Real Time PCR Kit (1x) und Seegene Seeplex Meningitis ACE Detection (1x).

RV 539: MRSA

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasen- oder Wundabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostischen Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie an dieser Stelle bereits mehrfach thematisiert basieren einige der derzeit etablierten eigenentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum Direktnachweis von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern, Staphylokokkenspezies-spezifischen Markern und dem mecA-Gen in der entsprechenden Nukleinsäurepräparation. Da sowohl bei S. aureus als auch bei Koagulase-negativen Staphylokokken das mecA-Gen für die phänotypische Ausprägung einer Methicillin-Resistenz verantwortlich ist, ist die Aussagekraft dieser PCR-gestützten Testsysteme für den Direktnachweis von MRSA aus nativem Patientenmaterial eingeschränkt, wenn beim Patienten eine gleichzeitige Besiedelung mit S. aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken (die als klinische Isolate zumeist mecA-positiv sind) vorliegt. Einen attraktiven Ansatzpunkt zur Lösung dieses Problems bieten sog. SCCmec-basierte PCR-Testkonzepte, die auf dem Nachweis der SCCmec-Kassette innerhalb eines für S. aureus charakteristischen Genbereiches beruhen und die relativ gut konservierte Integrationsstelle der SCCmec-Kassette im S. aureus-Genom als Zielsequenz verwenden. Dass aber auch die SCCmec-basierten Testkonzepte gewisse Limitationen haben, konnte im Rahmen einiger früherer Ringversuche eindrucksvoll aufgezeigt werden: hier wurden bereits einige MRSA-Isolate mit selten vorkommenden SCCmec-Subtypen oder MSSA-Isolate mit einer an den jeweiligen Enden typischen SCCmec-Sequenz, aber mit einer natürlichen Deletion des üblicherweise innerhalb der SCCmec-Kassette vorhandenen mecA-Gens versandt.

Da wir diesmal, abgesehen von einer Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (eine Konstellation die in der täglichen Praxis nicht gerade selten beobachtet wird), keine „interessanten“, „schwierigen“ oder komplexen Probenkonstellationen versandt haben, wurden von den insgesamt 310 Teilnehmern mit ihren unterschiedlichsten NAT-gestützten Testsystemen nahezu durchweg korrekte PCR-Ergebnisse für 3 der insgesamt 4 Proben des aktuellen Panels berichtet.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) der statistischen Auswertung dargestellt, enthielt die Probe # 1615391 diesmal ein Gemisch aus einem S. aureus-Isolat (MSSA, PVL-negativ, ~1x105 CFU/mL) und einer Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (S. epidermidis; mecA-positiv, ~5x105 CFU/mL), die Probe # 1615392 eine relativ hohe Menge eines Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (cMRSA; PVL-positiv; spa:t310, ~1x104 CFU/mL), die Probe # 1615394 eine etwas höhere Menge eines Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (cMRSA; PVL-positiv; spa:t008 ~1x105 CFU/mL), und die Probe # 1615393 ein „ordinäres“ mecA-negatives Staphylococcus epidermidis-Isolat (~1x103 CFU/ml).

Erfreulicherweise wurden im aktuellen Ringversuch bei der relativ stark positiven cMRSA-Probe # 1615394 von 309 der insgesamt 310 Teilnehmer durchweg korrekt positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt. Auch wenn sich in der zweiten MRSA-positiven Probe # 1615392 eine etwas geringere Menge an entsprechenden Zielorganismen befand, so ist die diesmal beobachtete Richtigkeitsquote von 99 % als durchaus respektabel zu bezeichnen. Für diese Probe wurden von 307 Teilnehmern korrekt positive Ergebnisse mitgeteilt. Der technische oder methodische Hintergrund der 2 falsch-negativen Ergebnisse bei dieser Probe ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Möglicherweise wurden von diesen beiden Teilnehmern selbstentwickelte (in-house) PCR-Testsysteme mit unzureichender analytischer Sensitivität eingesetzt oder es ging während der Probenaufarbeitung ein gewisser Anteil der Template-DNA bei der DNA-Isolierung oder der Komplettierung der PCR-Ansätze verloren. Angesichts der mit 1x104 CFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1615392 den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Im Vergleich zu früheren Ringversuchen mit vergleichbarer Probenkonstellation wurde bei Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies in Probe # 1615391 diesmal eine erfreulicherweise hohe Richtigkeitsquote erzielt. Von 286 der insgesamt 310 Teilnehmer wurde dieses Gemisch mit den jeweils eingesetzten Testsystemen korrekt als „MRSA-negativ“ befundet, weitere 7 Teilnehmer haben ihr Ergebnis bei dieser Probe als „fraglich“ klassifiziert. Von 5 dieser 7 Teilnehmer mit fraglichem Befund wurde explizit die Verwendung eines PCR-Testsystems angegeben, das auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern und dem mecA-Gen beruht. Damit dieser Art von Testsystemen zwar die Anwesenheit des mecA-Gens nachgewiesen werden kann, dessen Herkunft aber nicht zweifelsfrei dem Genom der ebenfalls nachgewiesenen S. aureus und/oder der Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies zugeordnet werden kann, ist in diesem Fall „fraglich“ auch das wissenschaftlich korrekte Untersuchungsergebnis.

Anmerkung des Ringversuchsleiters: Bei der Mitteilung von fraglichen Ergebnissen werden die entsprechenden Zertifikate in der Regel nur dann erteilt, wenn diese Teilnehmer bei den übrigen 3 Proben des Ringversuchs korrekte Ergebnisse angegeben haben.

Die restlichen 17 Teilnehmer berichteten bei dieser Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies falsch-positive Ergebnisse für MRSA. Diesen 17 Teilnehmern mit falsch-positivem Ergebnis für Probe # 1615391 ist dringend anzuraten, ihre Testsysteme zu überprüfen bzw. die methodische Eignung ihres jeweiligen Testkonzepts zu hinterfragen. In der mikrobiologischen Praxis wird relativ häufig die gleichzeitige Anwesenheit einer Methicillin-resistenten (also mecA-positiven) Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies und eines Methicillin-empfindlichen (also mecA-negativen) S. aureus-Isolates in dem entsprechenden Abstrichmaterial beobachtet. In diesem Fall würden die Testsysteme der letztgenannten 16 Teilnehmer vermutlich fälschlicherweise einen Hinweis auf das Vorliegen einer MRSA-Infektion bzw. -Besiedelung anzeigen (mit allen hinlänglich bekannten Konsequenzen für den betroffenen Patienten!).

Wenn man sich die entsprechenden Richtigkeitsquoten für Probe # 1615391 in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) nach Testkonzepten differenziert betrachtet, dann wird schnell ersichtlich dass alle der derzeit etablierten SCCmec-basierten Testsysteme bei diesem Gemisch korrekterweise MRSA-negative Befunde liefern (da das S. aureus-Genom der MSSA-Komponente ja de facto keine integrierte SCCmec-Kassette aufweist).

Bei der Probe ohne MRSA-Zielorganismen (# 1615393), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an einem „ordinären“ mecA-negativen Staphylococcus epidermidis-Patientenisolat enthielt, wurde im Rahmen des aktuellen Ringversuchs nur von 3 der 310 Teilnehmer ein falsch-positives MRSA Ergebnis beobachtet. Dabei liegt das Auftreten eines sporadischen laborinternen Kontaminationsereignisses oder einer Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe. Solche „Ausreißer“ sind bei technisch aufwändigen Ringversuchen mit über 300 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen meines Erachtens keiner weiteren Diskussion.

Insgesamt bleibt festzuhalten, dass der erfreulich große Anteil von richtig-positiven Ergebnissen bei der einen positiven Probe und die überwiegend richtig-negativen Befunde bei den 2 MRSA-negativen Proben erneut für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminations- und Verschleppungsereignissen spricht.

Abgesehen von der zuletzt diskutierten Probe spricht die Ergebnislage dieses Ringversuchs erneut für eine hohe Zuverlässigkeit des NAT-gestützten Direktnachweises von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial. Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit den Proben dieses Ringversuchs wieder standardisierte Rückstellproben zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine-Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende Ergebnisse wurden von 64 der insgesamt 310 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt und mit Ausnahme eines Teilnehmers waren diesmal sowohl die negativen, als auch die positiven Ergebnisse für die molekularbiologische PVL-Testung durchweg korrekt. Nähere Informationen zu der, nach wie vor hochaktuellen, cMRSA bzw. CA-MRSA Problematik finden sich beispielsweise unter: Linde et al. (2005) [5] oder Witte et al. (2005) [6]. Ein gut evaluiertes real-time PCR-Protokoll für den gezielten Nachweis von PVL-positiven S. aureus-Isolaten findet sich beispielsweise in: Reischl et al. (2007) [7]. Mittlerweile sind auch schon einige kommerzielle real-time PCR-Testsysteme für den zuverlässigen molekulargenetischen Nachweis von PVL-Genen bei MRSA- und MSSA-Isolaten verfügbar (z.B. von r-biopharm oder von TIB Molbiol).

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience Genotype MRSA (4x), HAIN Lifescience Genotype Staphylococcus (2x), HAIN Lifescience Genoquick MRSA (2x), Amplex easyplex MRSA (2x), r-biopharm RIDAGENE PVL PCR (1x), GeneProof MRSA PCR Kit (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID MRSA combi (1x) und Congen SureFast MRSA 4Plex (1x).

RV 540: Chlamydia pneumoniae

Eine wichtige Anmerkung wie immer vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine Probe mit relativ hoher Menge an entsprechenden Zielorganismen (# 1615404; Chlamydia pneumoniae, ~5x105 IFU/ml) und eine Probe mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1615401; Chlamydia pneumoniae, ~5x104 IFU/ml), eine Probe mit ca. ~1x104 IFU/ml an Chlamydia trachomatis (# 1615403), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1615402), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die beiden Proben ohne Zielorganismen # 1615402 und # 1615403 wurden mit einer bzw. zwei Ausnahmen korrekt als „negativ“ befundet. Hierbei dürfte es sich am ehesten um eine laborinterne Kontamination bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Kreuzreaktivitäten der C. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit DNA von E. coli erscheinen eher als unwahrscheinlich. Erfreulich ist auch, dass die Probe # 1615404 Chlamydia pneumoniae, ~5x105 IFU/ml) von 129 der 131 Teilnehmer als „positiv“ erkannt wurde. Leider wurden für die zweite Chlamydia pneumoniae-haltige Probe # 1615401 10 falsch-negative Resultate berichtet. Gegenüber vorausgehenden Ringversuchsrunden ist hier ein Anstieg nicht korrekter Ergebnisse zu verzeichnen. Da ebenfalls in vorausgegangenen Ringversuchen auch noch etwa zehnfach geringere Erregerlasten (ca. 103 IFU/mL) detektiert werden konnten, sollte ein falsch-negatives Ergebnis der C. pneumoniae-haltigen Proben sicherlich zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems und ggfs. auch die Prozessabläufe bei der Probenaufarbeitung zu hinterfragen. Inhibitionskontrollen wurden von 130 der 131 Teilnehmer durchgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden nicht berichtet.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 13 Teilnehmern die Verwendung des TIB Molbiol LightMix C. pneumoniae Testsystems, von 11 Teilnehmern der Diagenode MP/CP Kit und von 6 Teilnehmern der kommerzielle AmpliGnost CP PCR Kit angegeben. Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: GeneProof C. pneumoniae PCR Kit (9x), Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bac community acquired Pneumonia Kit (8x), Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bacterial Kit (1x), ARGENE Chla/Myco pneumo r-gene (3x), Seegene Seeplex PneumoBacter ACE Detection (3x), Seegene Anyplex RB5 detection (1x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (2x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 33 (2x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 21 (1x), Ingenetix Bacto Real M. pneumoniae (1x), Euroclone Duplica Real Time C. pneumoniae Detection Kit (1x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae (1x), r-Biopharm RIDAGENE C. pneumoniae (1x), Labsystems Diagnostics C. pneumoniae + M. pneumoniae Duplex Real-Time PCR (1x), Vircell Speed-oligo Chlamydophila pneumoniae (1x), RespiFinder SMART (1x) und DYNEX Real Time PCR PneumoPlex (1x).

RV 541: Mycoplasma pneumoniae

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern der vergangenen Ringversuche hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut, wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial, konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Dieses Mal waren jedoch keine Proben mit geringen Mengen an Zielorganismen im ausgesandten Probenset vertreten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben: Probe # 1615412 mit einer hohen Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x106 Genomkopien/mL), Probe # 1615414 mit einer etwa zehnfach geringeren Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x105 Genomkopien/mL) und # 1615413 mit einer etwa hundertfach geringeren Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x104 Genomkopien/mL). Probe # 1615411 enthielt ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli. Mit jeweils einer Ausnahme konnten die 143 Teilnehmer die DNA von M. pneumoniae in den Proben # 1615412 und 1615414 zuverlässig nachweisen. Die Probe # 1615413 mit der geringsten Menge an Zielorganismus wurde von 136 Labors als „positiv“ erkannt. Für die „negative“, mit E. coli (# 1615411) versetzte Probe wurden erfreulicherweise ausschließlich korrekte Ergebnisse berichtet. Inhibitionskontrollen wurden von 142 der 143 Teilnehmer mitgeführt, für keine der ausgesandten Proben wurden Inhibitionsereignisse berichtet. Zusammenfassend bleibt anzumerken, dass wie bereits in vorausgegangenen Ringversuchsrunden die PCR-/NAT-gestützte Diagnostik von Mycoplasma pneumoniae in vielen Labors robust und zuverlässig implementiert ist. Dieses positive Zwischenfazit sollte jedoch nicht zum Anlass genommen werden, die Anstrengungen zu reduzieren!

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 32 Teilnehmern die Verwendung von kommerziellen Testkits aufgeführt: LightMix M. pneumoniae [n=14], Minerva Venor Mp [n=1], AmpliGnost MP PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe [n=7], Diagenode MP/CP [n=10], sowie „andere kommerzielle Testsysteme“ [n=66]. Teilnehmer mit den ersten vier der aufgeführten Testkits konnten damit durchwegs Richtigkeitsquoten von 100 %, sowohl für die positiven als auch für die negativen Proben erzielen. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika CAP Bacterial Kit (9x), GeneProof M. pneumoniae PCR Detection Kit (9x), fast-track Diagnostics Kits (6x), Chla/Myco pneumo r-gene (3x), r-Biopharm RIDAGENE M. pneumoniae (3x), Ingenetix Bacto Real Mycoplasma pneumoniae (2x), Seegene PneumoBacter ACE detection (2x), Seegene Anyplex RB5 detection (2x), AmpliSens M. pneumoniae/C. pneumoniae-FEP PCR Kit (2x), Biolegio ReadyMax B-CAP Assay (2x), Euroclone Duplica Real Time M. pneumoniae Detection Kit (1x), Labsystems Diagnostics C. pneumoniae + M. pneumoniae Duplex Real-Time PCR (1x), RespiFinder SMART (1x), Vircell Speed-oligo Mycoplasma pneumoniae (1x) und DYNEX Real Time PCR PneumoPlex (1x).

RV 542: Coxiella burnetii & B. anthracis

Auch hier wieder eine Anmerkung vorweg: Der kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii & Bacillus anthracis ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Coxiella burnetii- und Bacillus anthracis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Coxiella burnetii (~5x103 Genomkopien/mL in Probe # 1615423 und ~5x104 Genomkopien/mL in Probe # 1615421), eine Probe mit DNA des Bacillus anthracis „Pasteur“-Isolats (~1x104 Genomkopien/mL in Probe # 1615423), eine Probe mit DNA des Bacillus anthracis UR-1 Isolats (~1x103 Genomkopien/mL in Probe # 1615422), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1615424), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Der Übersichtlichkeit halber haben wir uns bei diesem kombinierten Ringversuch entschlossen, die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen darzustellen: für Coxiella burnetii in den Tabellen 2 und 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 16) sowie für Bacillus anthracis in den Tabellen 4 und 5 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 17). Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Sacace Biotechnologies C. burnetii Real-TM (2x), Altona diagnostics RealStar Anthrax PCR Kit (2x), Liferiver C. burnetii real time PCR Kit (1x) und Life Technologies LSI VetMAX COX B ABSO QUANT (1x).

Coxiella burnetii: Wie bereits im vorausgegangenen Ringversuch gestaltet sich auch in der aktuellen Runde die Ergebnislage erfreulich. Die etwas stärker positive Probe # 1615421 mit ca. 5x104 Genomkopien C. burnetii/mL wurde von allen der insgesamt 30 Teilnehmer mit ihren jeweiligen C. burnetii-spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert. Die zweite positive Probe # 1615423 des Probesets (ca. 5x103 Genomkopien/mL von C. burnetii zusammen mit 1x104 Genomkopien/mL Bacillus anthracis „Stamm Pasteur“) wurde von 32 Labors korrekt berichtet, hier sind 2 falsch-negative Befunde zu registrieren. Dies ist im Vergleich zur vorausgegangenen Ringversuchsrunde eine Steigerung und sollte in den betroffenen Labors zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems zu hinterfragen und die Prozesse der Probenaufarbeitung ggfs. zu optimieren. Gleiches gilt für das falsch-positive und „fragliche“ Ergebnis der Probe # 1615422, welche nicht den Zielorganismus, sondern eine relevante Menge des Bacillus anthracis UR-1 Isolats enthielt. Da eine Kreuzreaktion der verwendeten Testsysteme eher unwahrscheinlich erscheint, sollten insbesondere Kontaminationsereignisse im Rahmen der Probenaufarbeitung ins Auge gefasst und abgestellt werden. Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von C. burnetii-DNA der Teilnehmer enthielten mit einer Ausnahme eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Bacillus anthracis: Die Ergebnislage des Ringversuchs „Bacillus anthracis-DNA“ ist ebenfalls relativ schnell dargestellt, allerdings muss im Vergleich zu vorausgehenden Ringsversuchsrunden eine unerfreuliche Zunahme falsch-positiver und -negativer Ergebnisse angemerkt werden. 19 der 20 Teilnehmer konnten mit ihren jeweils vor Ort etablierten B. anthracis-spezifischen PCR/NAT-gestützten Testsystemen die „negative“ Probe # 1615421 korrekt identifizieren, ein falsch-positives Ergebnis könnte am ehesten auf Kontaminationsereignisse bei der Probenaufarbeitung zurückgeführt werden, was aufgrund der weitreichende Konsequenzen des Befundes dringend zum Anlass einer detaillierten Nachschau genommen werden sollte. Von 17 der 20 Teilnehmer wurde die Probe # 1615422 (B. anthracis Stamm UR-1, ~1x103 Genomkopien/mL), gleiches gilt für die zweite „positive“ Probe (# 1615423), welche den B. anthracis-Stamm Pasteur zusammen mit ca. 5x103 Genomkopien/mL von C. burnetii enthielt. Zur kurzen Rekapitulation: B. anthracis Stamm Pasteur ist zwar positiv für das Virulenzplasmid pXO2 und die B. anthracis-spezifischen chromosomalen Sequenzmarker rpoB und dhp61, jedoch (im Gegensatz zum Stamm UR-1) negativ für das „lethal- und edema-factor, sowie protective antigen-(pagA)-“ tragende Virulenzplasmid pXO1. Aufgrund der nicht geringen Mengen des Zielorganismus im Probenmaterial sollte ein falsch-negatives oder fragliches Ergebnis bei den „positiven“ Proben # 1615422 und # 1615423 unbedingt zum Anlass genommen werden, die Performance des verwendeten Testsystems und ggfs die laborinternen Abläufe der Probenaufarbeitung zu prüfen. Wie immer stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für C. burnetii-DNA und B. anthracis-DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

RV 543: Francisella tularensis

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Francisella tularensis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 18) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal zwei positive Proben: Probe # 1615431 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (F. tularensis spp. tularensis, ~1x105 CFU/mL) und Probe # 1615433 mit ca. zehnfach geringerer Menge (F. tularensis spp. tularensis, ~1x104 CFU/mL). Im Ringversuchsprobenset befanden sich zudem zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1615432 und # 1615434), die nur humane Zellen und E. coli enthielten.

Ähnlich wie bei vorausgehenden Ringversuchen haben auch hier alle der 22 Teilnehmer die positiven Proben # 1615431 und # 1615423 als positiv identifiziert. Die F. tularensis-negative Probe # 1615434 wurde von allen Teilnehmern erfreulicherweise als negativ befundet, für die zweite „negative“ Probe # 1615432 wurde ein falsch-positives Ergebnis eingereicht. Die gesamte Ergebnislage deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorherigen Ringversuchen und spricht erneut für ein gutes Funktionieren sowohl der bei den jeweiligen Teilnehmern etablierten Testsysteme, als auch der implementierten laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von F. tularensis-DNA der Teilnehmer enthielten mit einer Ausnahme eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

RV 544: Carbapenemase-Gene

Der seit 2015 in das reguläre Ringversuchsprogramm von INSTAND e.V. aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Carbapenemase-Gene“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zur molekularen Resistenztestung bzw. dem Direktnachweis von charakteristischen Carbapenemase-Genen aus DNA-Präparationen von Reinkulturen an Enterobacteriaceae konzipiert. Zum orientierenden Herantasten an die technische Eignung und die „Praktikabilität“ der versandten Probenmaterialien werden wir uns in den ersten Runden dieses methodisch anspruchsvollen Ringversuchs zur molekularen Resistenztestung auf die Abprüfung eines kleinen Spektrum der derzeit häufigsten Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae beschränken: KPC, VIM, OXA-48 ähnliche Gene, GES-Carbapenemasen NDM, IMP und GIM. Im Gegensatz zur vorausgegangenen Ringversuchsrunde beschränkten wir uns diesmal auf die „mittlerweile gängigen“ Carbapenemasen.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 19) der Auswertung dargestellt, enthielt das aktuelle Set drei Proben mit Carbapenem-resistenten Enterobacteriaceae: Probe # 1615441 enthielt Klebsiella pneumoniae-Zielorganismen mit dem KPC-3 Gen (ca. 1x106 Genomkopien/mL), Probe # 1615442 enthielt Serratia marcescens-Zielorganismen mit dem NDM-1 Gen (ca. 1x106 Genomkopien/mL) und Probe # 1615444 enthielt E. cloacae-complex-Zielorganismen mit den Genen für OXA-48 und VIM-1 (ca. 1x106 Genomkopien/mL). Die vierte Probe # 1615443 war als eine Art von Negativkontrolle ausgelegt – sie enthielt lediglich E. coli ohne Carbapenemase-Gene.

Alle Teilnehmer stellten erfreulicherweise ein Carbapenemase-Gen in der Probe # 1615444 (E. cloacae-complex mit VIM-1 und OXA-48 Gen) fest. Ähnlich erfreulich waren die eingesandten Ergebnisse für die Probe # 1615442 (Serratia marcescens mit NDM-1 Gen): alle 61 Labors berichteten korrekt positive Ergebnisse. Für die Probe # 1615441 berichteten 59 der 61 Teilnehmer ein positives Ergebnis (Klebsiella pneumoniae-Zielorganismen mit den Genen für KPC-3). Ein falsch-negatives Ergebnis sollte Anlass geben, einerseits die „Coverage“ des verwendeten Carbapenemase-Assays zu evaluieren und sich andererseits der möglichen Lücken bewusst zu sein.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Direktnachweis von Carbapenemase-Genen aller Teilnehmer enthielten jeweils eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Sacace Biotechnologies MDR MBL Real-TM (1x), Sacace Biotechnologies MDR KPC/OXA Real-TM (1x), AmpliGnost Carbapenemase PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), Amplex eazyplex SuperBug complete A (1x) und Autoimmun Diagnostika Gen ID Carbapenemase (1x).

RV 545: Clostridium difficile

Der neu ins Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Clostridium difficile“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Clostridium difficile-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 20) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben zwei positive Proben. Probe # 1615451 mit einen relativ hoher Menge an Clostridium difficile, (~5x104 CFU/mL), Probe # 1615453 mit ca. zehnfach geringerer Menge (~5x103 CFU/mL) sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1615452 und # 1615454), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die beiden „positiven“ Clostridium difficile-Proben # 1615451 und # 1615453 wurden erfreulicherweise von 109 bzw. 108 der 110 teilnehmenden Laboratorien korrekt als „positiv“ klassifiziert. Falsch-negative Ergebnisse sollten auch hier zum Anlass genommen werden, das verwendete Testsystem bzgl. analytischer Sensitivität und Spezifität zu evaluieren und auch die laborinternen Prozesse der Probenaufbereitung und -Abarbeitung kritisch zu hinterfragen. Letzteres gilt insbesondere für Teilnehmer mit falsch-positiven Ergebnissen für die lediglich E. coli-enthaltende Proben # 1615452 und # 1615454. Eine Kreuzreaktion der verwendeten Testsysteme mit E. coli erscheint unwahrscheinlich, am ehesten sind Kreuzkontaminationen im Prozess der Probenbearbeitung ursächlich. Inhibitionskontrollen wurden von allen Teilnehmern mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse wurden für keine der Proben berichtet. Wie in Tab. 3 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 20) angegeben, verwendete der Großteil der Teilnehmer kommerzielle Testsysteme. In dieser Ringversuchsrunde zeigten sich (vergleichbar mit der vorausgegangenen) zwischen den kommerziellen Testsystemen und den Eigenentwicklungen keine signifikanten Unterschiede bezüglich Sensitivität und Spezifität.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: r-Biopharm RIDAGENE CD Toxin A/B (21x), r-Biopharm RIDAGENE Hospital Stool Panel (6x), Altona diagnostic RealStar C. difficile PCR Kit (10x), HAIN Lifescience GenoType CDiff (9x), AmpliGnost C. difficile Toxin A und B von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (2x), Meridian Bioscience illumigene C. difficile (2x), fast-track Diagnostics C. difficile (2x) und eazyplex C. difficile complete Assay (1x).

RV 546: VRE

Der neu ins Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Vancomycin-resistente Enterokokken“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an DNA Vancomycin-resistenter Enterokokken aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 21) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben drei positive Proben: Probe # 1615461 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (Enterococcus faecium mit vanB Gen, ~1x105 CFU/mL), Probe # 1615464 mit ca. gleiche Menge (Enterococcus faecium mit vanA-Gen, ~1x105 CFU/mL) und Probe # 1615462 mit ca. ~1x104 CFU/mL an vanA-positiven Enterococcus faecium. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (# 1615463), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Erfreulicherweise wurde die positive Probe # 1615461 (Enterococcus faecium mit vanB Gen, ~1x105 CFU/mL) von allen Teilnehmern korrekt als „VRE-positiv“ berichtet. Auch die vanA-positive Probe mit ~1x105 CFU/mL Enterococcus faecium wurde von 40 der 41 teilnehmenden Labors korrekt erkannt, während bei der „positiven“ Probe mit der geringsten Erregerlast (~1x104 CFU/mL Enterococcus faecium mit vanA-Gen) 5 falsch-negative Ergebnisse zu verzeichnen waren. Wie bereits im vorangegangenen Ringversuch waren alle eingereichten vanA/vanB-Differenzierungen korrekt. Im Vergleich zu vorausgegangenen Ringversuchsrunden war diesmal eine Steigerung der „falsch-negativen“ Ergebnisse zu verzeichnen, was zum Anlass genommen werden sollte die Sensitivität des verwendeten Testsystems sowie die Prozesse der Probenaufbereitung und -Analyse kritisch zu hinterfragen. Dies gilt selbstverständlich auch für die 2 Teilnehmer mit falsch-positiven Ergebnissen für Probe # 1615463, welche lediglich E. coli enthielt. Bei den eingesetzten Testsystemen hielten sich kommerziell erhältliche, vorkonfektionierte Systeme und Eigenentwicklungen in etwa die Waage. Bezüglich analytischer Sensitivität und Spezifität waren keine signifikanten Unterschiede zu verzeichnen, wenngleich einschränkend angemerkt werden muss, dass für eine verlässlichere Beurteilung weitere Ringversuchsrunden abgewartet werden sollten.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: HAIN Lifescience GenoType Enterococcus (8x), Roche LightCycler VRE Kit (1x), AmpliGnost Vancomycin A/B Resistenz differenz. von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), GeneProof VRE PCR Kit (1x) und QIAGEN artus VanR QS-RGQ Kit (1x).

RV 560: Pneumocystis jirovecii

Dieser im Jahr 2013 neu in unser Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch RV 560 „Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4er-Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Zum orientierenden Herantasten an die unteren Nachweisgrenzen der im Anwenderkreis etablierten PCR/NAT-gestützten Testsysteme enthielt das aktuelle Set drei positive Proben (siehe Tab. 1: Anhang 1 [Anh. 1], S. 22): eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1615601; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x106 Organismen/mL), eine Probe mit ca. zehnfach geringerer Menge (# 1615603; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x105 Organismen/mL), eine Probe mit ca. hundertfach geringerer Menge (# 1615604; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x104 Organismen/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1615602) aber mit E. coli und einer Suspension aus humanen Zellen.

Die „negative“ Probe # 1615602 wurde von nahezu allen Teilnehmern korrekt als negativ für den Zielorganismus gewertet, lediglich 1 falsch-positives Ergebnis wurde berichtet. Der betroffene Teilnehmer sollten ggfs. die laborinterne Testdurchführung und die Performance des verwendeten Testsystems überprüfen. Im Vergleich zur vorausgegangenen Ringversuchsrunde kann jedoch insgesamt ein weiterer Rückgang falsch-positiver oder fraglicher Befunde festgestellt werden. Bei den „positiven“ Proben wurde Probe # 1615601 mit ~1x106 Organismen/mL von 89 der 90 Teilnehmer richtig klassifiziert. Die schwächer positive Probe # 1615603 (ca. 1x105 Organismen/mL) wurde ebenfalls von 89 Teilnehmern korrekt als „positiv“ gewertet. Für die Probe mit dem geringsten Gehalt an Zielorganismus (# 1615604, ca. 1x104 Organismen/mL an Pneumocystis jirovecii) berichteten 6 Labors falsch-negative Ergebnisse. Wie bereits in der vorausgegangenen Ringversuchsrunde muss hier erneut angemerkt werden, dass 104 Organismen/mL nicht gerade als „äußerst geringe“ Menge gelten und durchaus mit adäquaten Testsystemen und Arbeitsabläufen detektierbar sind. Leider ist auch in dieser Ringversuchsrunde (im Vergleich zu den zwei vorherigen) erneut keine Steigerung der Performance zu sehen. Inhibitionskontrollen wurden von allen 90 Teilnehmern durchgeführt, Inhibitionsereignisse wurden nicht berichtet. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [26] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: fast-track Diagnostics Pneumocystis jirovecii (3x), fast-track Diagnostics Respiratory pathogens 33 (2x), Altona diagnostics RealStar P. jirovecii PCR Kit (2x) und SureFast Pneumocystis jirovecii PLUS (1x).

Danksagung

Wie gehabt möchten wir uns an dieser Stelle recht herzlich bei allen Kollegen in den zahlreichen nationalen und internationalen Sollwertlaboratorien sowie bei den Kollegen und Mitarbeitern in Jena, Salzburg, Hamburg, Oberschleißheim, Bonn, Dresden, München, Berlin, Bochum und Regensburg bedanken, die nach wie vor hochmotiviert an der praktischen Umsetzung unseres gemeinsamen Vorhabens zur externen Qualitätssicherung mitarbeiten.

Zugleich hoffen wir weiterhin auf rege Teilnahme und einen reibungslosen Ablauf der zukünftigen Ringversuchsrunden.


Literatur

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