gms | German Medical Science

Ziel der vorliegenden Studie ist es, eine Übersicht über die derzeit verwendeten Methoden für Nukleinsäureamplifikationstests (NATs) bei Infektionskrankheiten in Klinik- und Analyselaboratorien zu geben und neue Technologien für NATs vorzustellen, die potenziell zur Unterstützung einer schnellen und patientennahen Diagnostik (point-of-care (POC)) geeignet sind. Patienten-nah verwendete Geräte können einen unmittelbaren Einfluss auf die klinische Behandlung der Patienten haben und es ermöglichen, schnelle Entscheidungen über eine Therapie in einer einzigen Untersuchung festzulegen, so dass Nachuntersuchungen wegfallen. Damit kann der Patient angemessen und zeitnah behandelt werden. Die wichtigsten POC-Tests (POCT) zur Überwachung von Infektionserkrankungen umfassen schnelle, auf einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruhende Verfahren und neue isothermale Nukleinsäureamplifikationsmethoden. Durch die Entwicklung dieser auf einem Nukleinsäurenachweis basierender Verfahren wurde die Leistungsfähigkeit der Analysen, d.h. die Empfindlichkeit und die Spezifität der Methoden auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten, verbessert. Mit diesen Verfahren können die zeitaufwändigen und üblicherweise weniger empfindlichen mikrobiologische Methoden für den Nachweis von Infektionserregern durch die molekularbiologische Detektion der Pathogene ergänzt werden.

Wichtig für POC-Anwendungen sind niedrige Kosten und eine akzeptable Bearbeitungszeit oder Durchlaufzeit [1], [2], [3]. Die Durchlaufzeit hängt zusammen mit dem Begriff „Schnelldiagnostik“, dessen Bedeutung sich wesentlich geändert hat, seitdem es die PCR und isothermale Nukleinsäureamplifikationstechniken gibt. Während der MRSA-Nachweis, der auf der Verwendung chromogener Nährmedien beruht, normalerweise 2 bis 3 Tage braucht, erhält man mit dem PCR-Test das Ergebnis bereits in wenigen Stunden [1], [2]. Die Transportzeit von der Probenentnahme bis zum Labor trägt dabei erheblich zu den Durchlaufzeiten in PCR-gestützten Untersuchungen [2] bei. Durch die Verwendung von POC-Tests könnte dieser Beitrag vermieden werden. Mit Hilfe von isothermalen Nukleinsäureamplifikationstechniken werden die für die PCR notwendigen Thermozykler vermieden. Die Zeit bis zum Ergebnis kann so auf weniger als 60 Minuten oder sogar auf 20 Minuten verringert werden [3]. Die isothermale Amplifikationstechnik kann potenziell zur Integration von NATs in Einweg-Mikrochips verwendet werden [4], [5], [6], [7], entsprechende Geräte für die isothermale Amplifikation und ihren Nachweis sind im Vergleich zu der PCR-Technik einfacher. Daher ist neben der Schnelldiagnostik in Industrieländern die Anwendung des auf der isothermalen Nukleinsäureamplifikation beruhenden POC-Nukleinsäurenachweises für Entwicklungsländer äußerst interessant, weil speziell dort eine einfache Handhabung wichtig ist.

Die Literaturstudie zeigte, dass zahlreiche Methoden für den Nachweis von Nukleinsäuren entwickelt werden, die nicht auf der PCR, d.h. der Verwendung von Thermozyklern beruhen (Tabelle 1 [Tab. 1]). Im Handel erhältlich sind Geräte und dazugehörige Test-Kits, die auf der sogenannten branched DNA-Signalamplifikation (bDNA) [8], der Schleifen-vermittelten isothermalen Amplifikation (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) [9], [10] und der Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) [7] beruhen.

Für die bDNA-Methode wurde im Jahre 1995 [11] erstmals durch quantitative Messungen gezeigt, dass ein zuverlässiger HIV-1 Nachweis möglich ist. Später wurde die Leistungsfähigkeit der bDNA-Methode überprüft durch Vergleiche zwischen verschiedenen NAT-Methoden unter Verwendung des VERSANT HCV RNA Assays und des Siemens System 340 bDNA-Analysegerätes (Siemens Healthcare Diagnostics) [12], [13].

Die LAMP-Methode wird in dem von Eiken Chemical Co., Ltd. (Japan) entwickelten Echtzeit-Turbidimeter eingesetzt und dient beispielsweise für den Nachweis des Vogelgrippevirus Influenza A (H5N1)-Virus [14]. Lumora Ltd. (Vereinigtes Königreich) verwendet ebenfalls die LAMP-Methode in einem tragbaren Kleingerät (PDQ) und in einem Entwicklungssystem mit hohem Durchsatz. Im Gegensatz zur turbidimetrischen Methode wird dabei die Nukleinsäureamplifikation mit Hilfe von Fluoreszenzmessungen überwacht – dem so genannten biolumineszenten Echtzeit-Nachweis (bioluminescent assay in real-time, BART) [15]. Die von OptiGene gelieferten Geräte beruhen ebenfalls auf der LAMP-Methode, und der Hersteller liefert entsprechende Master Mix Kits (lizensiert für LAMP von Eiken Chemical Company) für die isothermale Verstärkung. Die RPA-Methode [7] wird von TwistDx, Ltd. (Vereinigtes Königreich) in ihrem tragbaren Echtzeit-Fluorometer Twista^® verwendet und für die Lebensmittelsicherheit, für die Reagenz-Kits verfügbar sind, eingesetzt.

Die Entwicklungen von verbesserten Varianten für LAMP und RPA dauern noch an. Anstelle von Displacement Primern werden „Stem Primer“ für die LAMP-Methode [16] verwendet. Mit Hilfe von chemischer Energieerzeugung konnte HIV-1 [17] nachgewiesen werden. Ein Vorteil der RPA-Methode ist, dass keine Anfangserwärmung (z.B. auf 95°C, um DNA-Einzelstränge zu erhalten) nötig ist und nur 37°C im Gegensatz zu 65°C bei der LAMP-Methode erforderlich sind. Dieses Verfahren wurde in einem mikrofluidischen Gerät im Westentaschenformat (Lab-on-a-foil) genutzt [18]. Ein weiteres aktives Forschungsfeld, das für die Schnell- und POC-Diagnostik von großem Interesse ist, ist die Miniaturisierung der Nukleinsäureamplifikationssysteme [19], die auch die Anpassung von NATs für den Einsatz in mikrofluidischen Chips [20] beinhaltet.

Zwei Fragebögen (siehe Anhang 1 [Anh. 1] und Anhang 2 [Anh. 2]) wurden erstellt, die für Hersteller oder für Endanwender spezifische Fragen beinhalten. Beide Umfragebögen enthalten auch gleiche Fragen, vorgesehen zur Beantwortung durch die Firmen und die Analyselaboratorien. Der Umfragebogen für die Endanwender wurde von INSTAND an 1.000 Analyselaboratorien in Deutschland verschickt, die regelmäßig an Ringversuchen für die externe Qualitätssicherung zum Nachweis von Infektionserregern durch NATs teilnehmen. Darüber hinaus kontaktierte INSTAND 336 Laboratorien aus anderen europäischen und nichteuropäischen Ländern. Diese Laboratorien betreiben die Diagnostik von Infektionskrankheiten im Bereich der Virologie, Bakteriologie, Mykobakteriologie, Parasitologie und Mykologie. Viele dieser Laboratorien bieten Diagnostikdienstleistungen in mehreren der oben genannten Bereiche an.

Wir haben Antworten von 48 Laboratorien aus 14 europäischen Ländern erhalten. Bis auf 2 Laboratorien bieten alle Analysen auf mehreren Gebieten der Infektiologie an. Drei Viertel der antwortenden Laboratorien führen monatlich mehr als 1.000 NAT-gestützte Analysen durch. Die Zahlen der teilnehmenden Laboratorien aus den jeweiligen Ländern sind in Abbildung 1 [Abb. 1] aufgeführt. Die meisten Teilnehmer kamen aus Deutschland und skandinavischen Ländern; wir erhielten jedoch auch Antworten aus dem Baltikum und osteuropäischen Ländern. Insgesamt wurden 36 Hersteller kontaktiert, von denen 12 geantwortet haben. Nur 8 der zurückgesandten Fragebögen konnten bei der Auswertung berücksichtigt werden, da sich 4 Hersteller auf die Entwicklung neuer Geräte oder Test-Kits konzentrieren und keinen direkten Kontakt zu Analyselaboratorien haben. Die Ergebnisse der Umfrage, die in den Tabellen 2, 3, 4 und 5 zusammengefasst sind, werden im Folgenden vorgestellt. In diesen Tabellen sind die häufigsten Antworten grau markiert.

Die Antworten auf herstellerspezifische Fragen sind in Tabelle 2 [Tab. 2] zusammengefasst. Die Mehrzahl der Hersteller bieten sowohl Geräte als auch besondere Test-Kits (Tabelle 2 [Tab. 2], Reihe 1) an. Ein Viertel der Antworten stammt von Firmen, die ausschließlich Geräte herstellen. Wenige Firmen (12%) konzentrieren sich auf die Entwicklung von Test-Kits für die Nukleinsäureamplifikation. Bezüglich der Anzahl an gelieferten Test-Kits (Tabelle 2 [Tab. 2], Reihe 2) für den Nachweis des humanen Cytomegalievirus (CMV), des Humanen Immundefizienz-Virus (HIV), der Hepatitis-B- und -C-Viren (HBV/HCV) liefern die meisten Hersteller (89%) mehr als 1.000 Tests pro Monat aus; die übrigen Firmen (11%) vertreiben 100 bis 1.000 Tests pro Monat.

Die Hälfte der Fluidik-Systeme basieren auf konventioneller Technik, wobei 38% der Firmen angeben, dass sie die Mikrosystemtechnologie anwenden (Tabelle 2 [Tab. 2], Reihe 3). Die Interpretation dieser Antworten gestaltet sich schwierig, da der Begriff „Mikrosystemtechnologie“, d.h. die Anwendung von Ultrapräzisions-Fräsmaschinen oder lithographischen Verfahren für die Herstellung von Prägewerkzeugen oder Spritzgusswerkzeugen mit Oberflächenrauheiten im Bereich von 10 nm, im Fragebogen nicht explizit definiert wurde. Von größerer Bedeutung für die praktische Anwendung ist das Volumen der für die Amplifikation verwendeten Küvette oder Kammer, da bei kleinerem Volumen weniger Material erforderlich ist und kürzere Amplifikationszeiten erwartet werden, insbesondere wenn die PCR-Methode angewandt wird. Für Küvettenvolumina zwischen 10 µL bis 20 µL und 20 µL bis 50 µL werden dieselben Zahlen (38%) angegeben, in einigen wenigen Fällen (13%) ist ein Volumen von über 50 µL erforderlich (Tabelle 2 [Tab. 2], Reihe 4). Andererseits zeigen die Antworten im Zusammenhang mit der für die Nukleinsäureamplifikation benötigten Zeit, dass bei Verwendung von geringen Küvettenvolumina keine wesentliche Zeitverkürzung erreicht wird. Sämtliche Antworten geben Amplifikationszeiten von über 25 Minuten (Tabelle 2 [Tab. 2], Reihe 5) an. Daraus folgt, dass der Beitrag der Amplifikationszeiten zur Durchlaufzeit nicht vernachlässigt werden kann und daher eine entsprechende Verkürzung der Amplifikationszeit äußerst wünschenswert wäre.

Die Marktanteile an Test-Kits und Geräten gemäß den Antworten der Analyselaboratorien sind in Abbildung 2 [Abb. 2] dargestellt. Abbildung 2a [Abb. 2] zeigt, dass für die Nukleinsäureamplifikation zu gleichen Anteilen hausinterne Tests (blaue Farbe, 14 Laboratorien) und Test-Kits der Fa. Roche (rot, 14 Nennungen) verwendet werden. Andere Lieferanten wurden weniger häufig genannt. Für jeden Anbieter wurde dieselbe Farbe in den Abbildungen 2a und 2b [Abb. 2] gewählt, um den Zusammenhang zwischen den für Nukleinsäureamplifikationstests angewandten Test-Kits und Geräten sichtbar zu machen. In Abbildung 2b [Abb. 2] werden sowohl die Geräte für die Nukleinsäureamplifikation als auch Apparaturen für die DNA/RNA-Extraktion und -Reinigung berücksichtigt. Aus Abbildung 2b [Abb. 2] ergibt sich, dass die Firma Roche nicht nur als Hersteller von Test-Kits sondern auch als Anbieter von Instrumenten (rot, 24 Laboratorien) der Marktführer ist. Als „hausinterner Test“ wird die Verwendung von einem „Nicht-Standard-Gerät“ interpretiert und ist daher blau markiert. Zu den übrigen Firmen, die Test-Kits und Geräte liefern, gehören Cepheid (8/11), Abbott (5/8), Qiagen (4/10), Applied Biosystems (1/4) und Becton Dickinson (1/4). Weitere Firmen, die entweder als Hersteller von Test-Kits (Altona Diagnostics, Amplex Biosystems, Fisher Scientific, GeneProof) oder als Hersteller von Geräten (BioRad, bioMérieux, Hologic, SensoQuest) bezeichnet werden, sind in unterschiedlichen Grautönen markiert.

In Tabelle 3 [Tab. 3] und Tabelle 4 [Tab. 4] sind die Antworten der Analyselaboratorien und die Antworten der Hersteller zu den für die Nukleinsäureamplifikation verwendeten Technologien, Erreger, Probenmaterialien, Arbeitsablauf, Durchlaufzeit, Empfindlichkeit und Preis aufgelistet.

Die PCR-Methode ist die am häufigsten von nahezu allen Analyselaboratorien (98%) angewandte und von den meisten Firmen (75%) angebotene Technologie. Die isothermale Nukleinsäureamplifikation wird in 8% der Analyselaboratorien verwendet, und 25% der Firmen stellen die entsprechenden Geräte und/oder Test-Kits her. Keiner der Umfrageteilnehmer – weder die Analyselaboratorien noch die Hersteller – gaben die Verwendung der branched DNA-Methode (bDNA) an. Die Microarray-Hybridisierung wurde ebenfalls aufgelistet (Tabelle 4 [Tab. 4], Reihe 1), sie ist jedoch aufgrund des geringen Potenzials für quantitative Messungen weniger relevant bezüglich der Erregeranalyse.

In Abbildung 3 [Abb. 3] haben wir die Antworten der Analyselaboratorien (blaue Balken) hinsichtlich der untersuchten Bakterien und Viren zusammengefasst, die im Fragebogen ausdrücklich als Multiple-Choice-Optionen aufgelistet waren. Die roten Balken in Abbildung 3 [Abb. 3] stellen die Antworten der Hersteller zur Lieferung der entsprechenden Test-Kits dar. Die Analyselaboratorien (Tabelle 3 [Tab. 3], Reihe 2) gaben an, dass Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), Influenza-A-und Influenza-B-Viren sowie Hepatitis-B- und -C-Viren (HBV/HCV) in jeweils mehr als 50% der Laboratorien nachgewiesen werden. M. tuberculosis (27%), das humane Cytomegalievirus (CMV) (40%), Adenovirus (35%), das Humane Immundefizienz-Virus (HIV) (48%) und das Epstein-Barr-Virus (EBV) (40%) werden ebenfalls häufig analysiert. Andererseits verfügen nur wenige Laboratorien (6%) über die Molekulardiagnostik für das SARS-assoziierte Coronavirus (SARS-CoV), welches der Verursacher des schweren akuten Atemwegsyndroms ist.

Für sämtliche dieser NATs gibt es handelsübliche Test-Kits, die von einigen Herstellern geliefert werden. Gemäß Tabelle 4 [Tab. 4], Reihe 2 werden von den antwortenden Firmen Test-Kits angeboten für Influenza-A- und Influenza-B-Viren (50%) sowie MRSA, CMV und EBV (jeweils 38%). Ein geringerer Anteil der Firmen liefern Test-Kits für M. tuberculosis, HIV und HBV/HCV (jeweils 25%) sowie für Adenovirus und SARS-CoV (jeweils 13%).

M. tuberculosis wird in 27% der Analyselaboratorien getestet (Tabelle 3 [Tab. 3], Reihe 2). Wie in Referenz [21] angegeben, wird in den östlichen WHO-Mitgliedstaaten M. tuberculosis viel häufiger gemeldet als in den westlichen WHO-Mitgliedstaaten. Dieser Tuberkulosebericht 2014 der WHO zeigt für die mehrfach arzneimittelresistente Tuberkulose (MDR-TB) weltweit einen Anstieg neuer Fälle von 3,5% im Jahr 2013. In einigen Ländern jedoch – Russische Föderation, Usbekistan, Moldawien, Kasachstan, Kirgistan und Weißrussland – lag der Anstieg neuer Fälle zwischen 19%–35% in den Jahren 2011–2013. Besorgniserregend ist dabei der erhebliche Anteil von extrem resistenten (XDR) M. tuberculosis-Stämmen und der fortwährende Rückgang der Erfolgsrate bei medikamentöser Tuberkulosetherapie.

Die prozentuale Häufigkeit bei der Anwendung von Tests zum Nachweis von Infektionserregern in den antwortenden Laboratorien sowie die Lieferung von handelsüblichen Diagnosetests durch die antwortenden Hersteller (Abbildung 3 [Tab. 3]) scheint den Diagnosebedarf der entsprechenden Methoden für das öffentliche Gesundheitswesen in den Ländern, aus denen die Antworten kamen (Teile Nord-, Ost- und Mitteleuropas), widerzuspiegeln. Dieser Zusammenhang mag sowohl für MRSA als auch für HBV/HCV und die Influenza-A- und Influenza-B-Viren gelten. Interessanterweise halten die antwortenden Laboratorien an Diagnosetests für den Nachweis des SARS-CoV fest, obwohl es seit 2004 nirgendwo auf der Welt bekannte Fälle von SARS-CoV-Infektionen gegeben hat (http://www.cdc.gov/coronavirus/about/index.html).

Neben den Erregern, die ausdrücklich im Fragebogen aufgeführt sind, wurden die Teilnehmer auch gebeten, andere relevante Bakterien und Viren anzugeben. Die häufigsten Antworten sind in Tabelle 3 [Tab. 3], Reihe 3 zusammengefasst. Neben Chlamydia trachomatis, das in 44% der Laboratorien nachgewiesen wird, werden Norovirus (27%), HSV-1/HSV-2 (27%), Varizella-Zoster-Virus (23%), Neisseria gonorrhoeae (23%) und Mycoplasma genitalium (17%) analysiert.

Die Verteilung des für NATs verwendeten Untersuchungsmaterials ist in Abbildung 4 [Abb. 4] dargestellt. Aus der Antwort der Analyselaboratorien lässt sich schließen (Abbildung 4 [Abb. 4], blaue Balken; Tabelle 3 [Tab. 3], Reihe 4), dass meistens Abstriche (83%) und Blut/Blutplasma (60%) verwendet werden. Neben diesen Proben werden Urin (44%), Biopsie-Gewebe (38%), Stuhlproben (33%), bronchoalveoläre Lavage (BAL) (25%), Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) (21%) und Sputum (13%) für die NAT verwendet. Die Prozentsätze an Herstellern, die Test-Kits für diese Untersuchungsmaterialien herstellen (Tabelle 4 [Tab. 4], Reihe 3), sind als rote Balken in Abbildung 4 [Abb. 4] dargestellt. Die meisten Nennungen beziehen sich auf Stuhlproben (50%), Abstriche (46%) und Blut/Blutplasma (36%), gefolgt von Gewebeproben (22%). Diese Proben sind die vier am häufigsten von den Analyselaboratorien genannten Materialien.

Im Fragebogen sind drei Möglichkeiten für den Ablauf von NATs angegeben. (i) Die manuelle Präparation erfordert eine DNA-/RNA-Extraktion, -Aufreinigung sowie die Pipettierung von Reagenzien. (ii) Komplett-Tests umfassen die automatisierte Präparation und Amplifikation in einem oder verschiedenen Geräten. (iii) Vollständige Kartuschentests oder kassettengestützten Test umfassen sämtliche benötigten Reagenzien, so dass nur das Untersuchungsmaterial eingebracht werden muss. Wie in Abbildung 5 [Abb. 5] und Tabelle 3 [Tab. 3], Reihe 5 dargestellt, wird in 33% der Fälle die manuelle Präparation in den Analyselabors verwendet. Gegenwärtig werden Tests vorgezogen, die die automatisierte Präparation (63%) der Proben umfassen. Vollautomatisierte Kartuschen- oder Kassetten-Tests werden in 21% der Laboratorien verwendet. Die Summe beträgt mehr als 100%, da in einigen Laboratorien verschiedene Methoden parallel verwendet werden. Die Hersteller (Tabelle 4 [Tab. 4], Reihe 4) haben am häufigsten die manuelle Präparation (63%) angegeben, die automatisierte Präparation wird in 25% und die Verwendung von Kartuschentests in 13% der Fälle genannt. Im Vergleich zu den Analyselaboratorien ist die Reihenfolge im Falle der manuellen und der automatisierten Präparation umgekehrt, möglicherweise weil die meisten Laboratorien einen hohen Durchlauf haben, der ein Höchstmaß an Automatisierung erfordert. Übereinstimmend rangieren bei beiden Gruppen Kartuschen-Tests an dritter Stelle; der relative Marktanteil beläuft sich schätzungsweise auf 10% bis 20%.

Laut Analyselaboratorien (Tabelle 3 [Tab. 3], Reihe 6) liegt die Durchlaufzeit für den Nachweis von Infektionserregern mit Hilfe von NATs üblicherweise über 2 h (77%), 23% gaben Durchlaufzeiten zwischen 1 h bis 2 h und 2% sogar unter 60 min an. Die Analyseempfindlichkeit oder Nachweisgrenze in reinen Untersuchungsmaterial oder Kalibratoren, welche von den meisten Analyselaboratorien für den verlässlichen Erregernachweis gefordert wird, ist ungefähr gleich bei <10 Kopien mL^–1 (29%), 10 Kopien mL^–1 bis 50 Kopien mL^–1 (26%) und 50 Kopien mL^–1 bis 100 Kopien mL^–1 (31%) (Tabelle 3 [Tab. 3], Reihe 7). Die von den Analyselaboratorien angegebene große Bandbreite beruht vermutlich auf der Tatsache, dass erreger- und probenspezifische Empfindlichkeiten und Nachweisgrenzen für die verlässliche Diagnostik erforderlich sind. Die Antworten der Hersteller auf diese Fragen stimmen gut überein mit dem Bedarf der Analyselaboratorien und zeigen Tendenzen zu niedrigeren Durchlaufzeiten (38% geben eine Spanne von 1 h bis 2 h an) (Tabelle 4 [Tab. 4], Reihe 5) und zu einer höheren Empfindlichkeit (50% geben eine Empfindlichkeit von 10 Kopien mL^–1 bis 50 Kopien mL^–1 an; siehe Tabelle 4 [Tab. 4], Reihe 6). Die vertretbaren Kosten für die geforderten Tests werden jedoch von den Analyselaboratorien im Vergleich zu den Herstellern niedriger angegeben. Der Bereich bis zu 4 € pro Test wird von 66% der Analyselaboratorien (Tabelle 3 [Tab. 3], Reihe 8) und 42% der Firmen (Tabelle 4 [Tab. 4], Reihe 7) genannt. Die von den Laboratorien genannte Obergrenze liegt bei 6 €, die Hersteller geben jedoch an, dass die Kosten für einige Test-Kits (57%) über 8 € liegen. Auch hier zeigt die breite Spanne an akzeptablen Kosten und kostendeckenden Preisen, dass für unterschiedliche Erreger und Untersuchungsmaterialien die Komplexität der Test-Kits und die entsprechenden Aufwendungen für die Entwicklungen ausschlaggebend sind.

In Tabelle 5 [Tab. 5] sind die Antworten auf die für die Analyselaboratorien spezifischen Fragen aufgeführt. Wie bereits erwähnt, untersuchen die meisten Analyselaboratorien (75%) mehr als 1.000 Proben pro Monat auf Infektionserreger (Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 1). Dabei verwenden die Laboratorien überwiegend Komplett-Tests mit automatisierter Präparation und Amplifikation sowie vollständige Kartuschentests oder kassettengestützte Tests (siehe Tabelle 3 [Tab. 3], Reihe 5: Summe 84%). Bei hohem Probendurchsatz ist die Automatisierung notwendig, um Analysen in kurzer Zeit zu vernünftigen Kosten anbieten zu können. Ungefähr 21% der Nutzer führen 100 bis 1.000 Tests pro Monat und 4% der Analyselaboratorien weniger als 100 Tests pro Monat durch. Der relative Anteil an NATs an sämtlichen Analysen deckt das komplette Spektrum von <25% bis >75% ab, wobei der Bereich <25% am häufigsten, von 54% der Laboratorien (Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 2), angegeben wurde. Die Verteilung zeigt ein zweites (relatives) Maximum: 23% der Laboratorien führen in mehr als 75% der Analysen Nukleinsäureamplifikationstests durch. Dieses Umfrageergebnis zeigt die steigende Bedeutung von Nukleinsäureamplifikationstests. Mehr als der Hälfte aller Laboratorien (54%) benutzt die NATs zusätzlich zu anderen Diagnosemethoden. In spezialisierten Einrichtungen (23%) werden NATs als das wichtigste Verfahren eingesetzt (Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 2).

In der Umfrage gaben ungefähr 40% (Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 3) der Analyselaboratorien an eine „schnelle“ PCR/NAT zu verwenden. Allerdings wird diese Aussage nicht von den Antworten bezüglich der Durchlaufzeiten unterstützt, da nur 2% der Laboratorien Zeiten unter 60 Minuten (Tabelle 3 [Tab. 3], Reihe 6) erreichen. Diese 2% der Laboratorien scheinen die derzeitige Situation besser widerzuspiegeln als die 38%, die in Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 3 im Bereich der „schnellen“ Schnelldiagnostik angegeben sind. Wir interpretieren diese Diskrepanzen als nicht konforme Definitionen und schlagen die Verwendung des Begriffs „schnelle“ PCR/NATs als charakteristisch für Durchlaufzeiten unter 30 Minuten vor, um dem neuesten Stand der Technik der NATs besser Rechnung tragen zu können.

Die Bakterien und Viren, für die die Analyselaboratorien schnelle Nukleinsäuretests benötigen, sind in Abbildung 6 [Abb. 6] (Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 4) aufgeführt. Der Prozentsatz an Laboratorien, die einen Schnelltest nachfragen, wird auf einer logarithmischen Skala angezeigt, um die großen Variationen darzustellen.

Für alle im Fragebogen aufgeführten Erreger, mit der Ausnahme von SARS, gibt es Interesse an erheblich kürzeren Durchlaufzeiten. Die meisten Nutzer wünschen eine Durchlaufzeit unter 15 min (72%, Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 5). Allerdings reicht die Zahl der Laboratorien, die solche schnellen NATs nachfragen, von nur 2% für M. tuberculosis, Adenovirus, HIV und EBV bis zu 54% für MRSA. Neben MRSA zeigt ein Großteil der Antworten den Bedarf an Schnelltests für das Norovirus (27%) und die Influenza-A- und -B-Viren (21%). Ungefähr 10% der Analyselaboratorien haben einen Bedarf für schnelle CMV- und HBV/HCV-Nukleinsäuretests. In Abbildung 6 [Abb. 6] ist – auf der Grundlage der häufigsten Aussagen – die erwartete Anzahl an Schnelltests (Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 6) für jedes Analyselabor als Farbcode angegeben: violett steht für <10 Tests pro Monat, hellbraun für 10 bis 50 Tests pro Monat und grün für >50 Tests pro Monat. Alternativ zur Darstellung der erwarteten erregerspezifischen Testanzahl wird in Abbildung 7 [Abb. 7] die Summe aller erwarteten Test pro Analyselabor angegeben. Aus Abbildung 7 [Abb. 7] folgt, dass die meisten Endnutzer, die schnelle NATs verwenden möchten, mit mehr als 50 Tests pro Monat rechnen. Dabei ist zu beachten, dass die Gesamtzahl an Nennungen (60) die Zahl der teilnehmenden Laboratorien (48) übersteigt, da üblicherweise mehr als ein Erreger in jedem Analyselaboratorium analysiert wird. Verglichen mit dem typischen Durchlauf von >1.000 Analysen pro Monat läge der relative Anteil an Schnelltests in der Größenordnung um 5%.

Auf die Frage, ob qualitative oder quantitative Tests benötigt werden, gab es verschiedene Antworten. Entsprechend Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 7 machen die meisten Analyselaboratorien (44%) die Wahl zwischen einem qualitativen oder quantitativen Test von dem nachzuweisenden Erreger abhängig. Mit einem qualitativen Ergebnis wären 31% der Analyselaboratorien zufrieden.

Die Antworten bezüglich des Kaufs von Geräten (Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 8) und der Etablierung schneller Nukleinsäuretests in Analyselaboratorien (50% möchten keine Schnelltests einführen und 19% antworteten mit "später als in den nächsten drei Jahren") zeigen, dass die Endnutzer derzeit abwarten, möglicherweise weil die Technologien für schnelle NATs noch in der Entwicklung sind und durch entsprechende Forschungsaktivitäten weiter verbessert werden.

Die Ergebnisse der vorliegenden Umfrage beziehen sich auf die Antworten von 48 Analyselaboratorien, die meisten davon mit Sitz in Deutschland. Ungefähr ein Viertel der Antworten kam aus skandinavischen Ländern. Abgesehen von den Kosten herrschte bezüglich des derzeitigen Stands der NAT-Technik im Großen und Ganzen Konsens zwischen Endnutzern und Herstellern, wenngleich nur 8 Firmen geantwortet haben.

Zu den am häufigsten, in mehr als der Hälfte der Laboratorien analysierten Erregern gehören MRSA, Influenza-A- und -B-Viren und HBV/HCV, gefolgt von HIV, EBV, CMV und dem Adenovirus, das in ungefähr 40% der Laboratorien nachgewiesen wird. M. tuberculosis wurde von 27% der Analyselaboratorien als nachzuweisendes Pathogen angegeben. Neben diesen Erregern, die im Fragebogen explizit als Multiple-Choice-Option gelistet waren, werden häufig auch Chlamydia trachomatis, Norovirus und Neisseria gonorrhoeae (in 20% bis 40% der Laboratorien) analysiert.

Die Mehrzahl der teilnehmenden Analyselaboratorien führt mehr als 1.000 Analysen pro Monat durch, um Infektionskrankheiten nachzuweisen. Daher ist ein hohes Maß an Automatisierung erforderlich, um einen hohen Probendurchlauf zu erreichen, wobei konventionelle Komplett-Tests oder vollständige Kartuschen-Tests verwendet werden. Der relative Anteil an hausinternen Tests für die Nukleinsäure-Extraktion/-Aufreinigung und -Amplifikation beträgt ungefähr 27%. Dagegen verwenden 73% der Analyselaboratorien Test-Kits, die von unterschiedlichen Herstellern geliefert werden. In diesem Zusammenhang ist die interne und externe Qualitätssicherung äußerst wichtig, um sicherzustellen, dass Ergebnisse aus unterschiedlichen Laboratorien innerhalb der Bewertungsgrenzen, die für bestimmte Erreger in den entsprechenden Richtlinien [22] der Bundesärztekammer geregelt sind, liegen.

Die Umfrage zeigt, dass aufgrund der dramatischen Reduzierung der für die Kultivierung von Pathogenen notwendigen Durchlaufzeiten von mehreren Tagen auf 2 h – 4 h nach der Einführung von PCR der Begriff „schnelle“ Analyse uneinheitlich verwendet wird. Aus dem Fragebogen ergibt sich, dass der derzeitige Stand der Technik für die Durchlaufzeit von PCR-gestützten Nukleinsäuretests immer noch bei >2 h liegt. Es ist zu erwarten, dass der nächste Schritt hin zu einer schnellen und patientennahen Diagnostik durch die Implementierung von vollständigen Tests mit einer isothermalen Methode für NATs erfolgen wird. Mit derartigen Testsystemen können Durchlaufzeiten unter 30 min erreicht werden, möglicherweise lassen sich Zeiten zwischen 10–15 min erreichen. Daher bietet sich als Definition für einen schnellen Nukleinsäureamplifikationstest eine Analyse mit Durchlaufzeiten von <30 min an. Für schnelle NATS ist die Verwendung von vollständigen Kartuschentest mit integrierten mikrofluidischen Chips ein vielversprechender Ansatz. Von besonderem Interesse ist dabei die RPA [7]; [23], da die Amplifikation bei ungefähr 37°C durchgeführt werden kann.

Die Mehrheit der Laboratorien (75%) weist auf den Bedarf an schnellen Nukleinsäuretests für bestimmte Erreger hin. Für mehr als 50% der Analyselaboratorien ist MRSA besonders wichtig, 27% fordern schnelle NATs zum Nachweis des Norovirus und 21% fragen nach schnellen NATs zum Nachweis der Influenza-A- und Influenza-B-Viren (Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 4). Nach Aussage von ungefähr 10% der Laboratorien werden schnelle Tests für weitere Erreger wie HBV HCV und CMV benötigt. Die gewünschte Durchlaufzeit für schnelle Nukleinsäuretests zum Nachweis dieser Krankheitserreger beträgt <15 min (Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 5). Etwas mehr Laboratorien gaben an (44% verglichen mit 31%, Tabelle 5 [Tab. 5], Reihe 7), dass – je nach Krankheitserreger – quantitative Tests den qualitativen Analysen vorzuziehen wären. Die Ergebnisse des Fragebogens erlauben die Abschätzung, dass der relative Anteil an NATs verglichen mit der monatlichen Gesamtzahl an Analysen etwa 5% beträgt. Dabei ist anzumerken, dass die Bakterien und Viren, für die Schnelltests angefordert werden, derzeit in den an der Umfrage teilnehmenden Laboratorien häufig mittels PCR nachgewiesen werden.

Neben der herkömmlichen Nukleinsäure-Amplifikationsmethode mittels PCR wenden nur wenige Laboratorien (8%) isothermale Amplifikationstechniken an. Dies zeigt, dass auch weiterhin Forschung und Entwicklung notwendig sind, um die Nachteile der isothermalen Methoden für Nukleinsäure-Amplifikation zu überwinden. Insbesondere würde die Möglichkeit, quantitative Ergebnisse zu erhalten, die Anwendung isothermaler Tests in Routine-Laboratorien und für POC-Anwendungen sicherlich beschleunigen. Darüber hinaus müssen isothermale Tests in Einwegkartuschen integriert werden, um die Handhabung und Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Durchlaufzeit auf den geforderten Bereich von <15 min zu verringern. Aufgrund der laufenden Entwicklung warten die meisten Endnutzer (85%) immer noch ab, bevor sie die entsprechende Ausrüstung für die schnelle (isothermale) Nukleinsäureanalyse beschaffen. Die Antworten der Umfrage erlauben allerdings die Schlussfolgerung, dass für einige Anwendungen schnelle NATs benötigt werden, um die messtechnische Unterstützung für diagnostische und therapeutische Entscheidungen zu verbessern.

Heinz Zeichhardt und Hans-Peter Grunert besitzen Geschäftsanteile bei der GBD (Gesellschaft für Biotechnologische Diagnostik) mbH, Berlin. Die GBD ist Hersteller von Materialien für die externe Qualitätskontrolle. Die anderen Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Der Fragebogen wurde an Analyselaboratorien verschickt, die an den von INSTAND e.V. (Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in medizinischen Laboratorien e.V., Düsseldorf, Deutschland) organisierten Ringversuchen zur externen Qualitätssicherung für Nukleinsäuretests teilnehmen. Wir danken INSTAND e.V. – insbesondere Michael Spannagl, dem Vorsitzenden von INSTAND, sowie Ingo Schellenberg, dem stellvertretenden Vorsitzenden von INSTAND – für ihre Unterstützung. Die Arbeit wurde von der Europäischen Union im Rahmen des European Metrology Research Programme (EMRP) HLT-08, 2011 ‘INFECT-MET’ gefördert.