gms | German Medical Science

Nach erfolgreicher Etablierung dieser neuen Ringversuchs-Serie wollen wir hier auch für Kolleginnen und Kollegen, die bisher noch nicht an diesen Ringversuchen teilgenommen haben, die Ergebnisse der aktuellen Ringversuche für den NAT-gestützten Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, EHEC/STEC, Borrelia burgdorferi sensu lato, Legionella pneumophila, Salmonella enterica und Listeria spp., MRSA bzw. cMRSA, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetti, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Pneumocystis jirovecii (vorm. P. carinii) sowie dem neu ins Programm aufgenommenen Ringversuch zur molekularen Resistenztestung für Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae darstellen und kurz diskutieren.

Für nähere Informationen über die Zusammensetzung der Ringversuchsproben, dem Sinn und Zweck dieser neuen Möglichkeit zur externen Qualitätskontrolle im Umfeld der Nukleinsäurediagnostik sowie zu den Eckdaten unseres flexiblen Ringversuchskonzepts sei hier auf unsere initiale Veröffentlichung in der Zeitschrift „Der Mikrobiologe“ verwiesen [1]. Gerne werden wir hier auch weiterhin in regelmäßigen Abständen und in ähnlicher Form über die Ergebnislage, Auswertung und Analyse unser zukünftigen Ringversuche berichten.

Wie bei allen anderen Ringversuchen erfolgt die Anmeldung zu ausgewählten Teilen der Reihe „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ über die Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in Medizinischen Laboratorien (INSTAND e.V.), Düsseldorf (http://www.instandev.de/). Nach Abschluss des jeweiligen Ringversuchs werden die Ergebnisse der einzelnen Teilnehmer dort zentral erfasst und anhand von individuellen Bewertungskriterien werden die schriftlichen Zertifikate erstellt. Zusätzlich stehen für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe weiterer Informationen auch im Internet unter http://www.udo-reischl.de, Unterpunkt „INSTAND-Ringversuche (PCR/NAT)“, sowie auf der Homepage von INSTAND e.V. als pdf-Files zum freien Download bereit.

Neben der Aussendung von lyophilisierten Probenmaterialien zur systematischen Abprüfung von NAT-gestützten Testsystemen für derzeit 16 unterschiedliche bakterielle und fungale Zielorganismen bzw. Pathogenitätsfaktoren gab es im Rahmen dieser Ringversuchsrunde auch wieder gewisse „highlights“: so wurde beispielsweise im aktuellen RV 532 Bordetella pertussis eine Probe mit der zum Zielorganismus verwandten Spezies Bordetella holmesii versandt, die ebenfalls das populäre Zielgen IS481 enthält und daher von vielen unserer Ringversuchsteilnehmer als PCR-positiv getestet wurde. Als weiteres „Highlight“ innerhalb der aktuellen Ringversuchsrunde wurde in einer der 4 Einzelproben des RV 539 MRSA/cMRSA ein spezielles S. aureus-Isolat versandt, das alle derzeit gebräuchlichen genotypischen Marker für MRSA aufweist, sich in der konventionellen Testung auf phänotypischer Ebene aber zweifelsfrei als MSSA-Isolat erweist. Erwartungsgemäß wurde dieses S. aureus-Isolat von allen Teilnehmen mit ihren PCR-gestützten Testsystemen als MRSA identifiziert. Auch wenn solche MSSA-Isolate derzeit noch sehr selten zu beobachten sind, so soll mit der Mitführung dieses Isolats bei den Teilnehmern und innerhalb der Leserschaft dieser Ringversuchsdiskussion zumindest das Bewusstsein für das mögliche Vorkommen von S. aureus-Isolaten mit solch untypischen genetischen Konstellationen geweckt werden.

Nach dem erfolgreichen Verlauf der Proberingversuchs-Runde im Mai diesen Jahres wurde der neue RV 544 zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von Carbapenemase-Genen bei Enterobacteriaceae nun in das reguläre Ringversuchsprogramm „Bakteriengenom-Nachweis PCR/NAT“ von INSTAND e.V. aufgenommen und zukünftig halbjährlich angeboten. Zumindest in der Anfangsphase dieses methodisch anspruchsvollen Ringversuchs zur molekularen Resistenztestung werden wir uns auf das Spektrum der derzeit häufigsten Carbapenemase Gene beschränken: KPC, VIM, OXA-48, GES Carbapenemase, NDM, IMP und GIM. Bei der Auswahl von „ringversuchswürdigen“ Isolaten ist unser geschätzter Kollege Dr. Martin Kaase vom Nationalen Referenzzentrum für Gram-negative Krankenhauserreger, Abteilung für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr Universität in Bochum natürlich eng eingebunden.

An prominenter Stelle möchten wir uns diesmal besonders herzlich bei Herrn Dr. Jan Marco Kern und Herrn Matthias Pöckl (Universitätsinstitut für Medizinisch Chemische Labordiagnostik, Division Medizinische Mikrobiologie, Paracelsus Medizinische Privatuniversität an den Salzburger Landeskliniken) für die Bereitstellung von großen Mengen an Chlamydia pneumoniae-positivem Zellkulturmaterial bedanken. Ohne seine tatkräftige und kollegiale Unterstützung wäre die zeitnahe Herstellung der überraschend großen Probenzahlen für den Ringversuch RV 540 sicherlich nicht so reibungslos möglich gewesen...

Aktueller Hinweis auf neue Ringversuche in 2015: Aufgrund zahlreicher Anfragen aus dem Teilnehmer- und Kollegenkreis werden ab Mai 2015 zwei zusätzliche Ringversuche eingeführt: RV 545 zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von Clostridium difficile (Toxingene) sowie RV 546 zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken). Für diese Zielorganismen sind bereits eine Reihe von kommerziellen und eigenentwickelten Verfahren zum PCR-gestützten Direktnachweis verfügbar und es wird interessant sein zu verfolgen wie gut sich diese in den kommenden Ringversuchsrunden bewähren. Bitte melden Sie sich rechtzeitig auf dem regulären Weg bei INSTAND e.V. an, falls sie an einer Teilnahme interessiert sind.

Alle Teilnehmer sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt.

In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit relativ geringer Menge folgender Zielorganismen: Borrelia burgdorferi (Probe # 1425351), Listeria spp. (Probe # 1425382), Coxiella burnetii (Probe # 1425424), Bacillus anthracis (Probe # 1425424) sowie Pneumocystis jirovecii (Probe # 1425604). Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze, u. a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker, für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen.

An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind, und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Mit Ausnahme der zuvor erwähnten „grenzwertig positiven“ Einzelproben wurden die Mengen der entsprechenden Zielorganismen in den Probensätzen der aktuellen Ringversuchsrunde wieder relativ deutlich über der Nachweisgrenze von „durchschnittlich sensitiven PCR/NAT-Testkonzepten“ eingestellt. Diese definieren wir wie folgt: als Richtwert für die Bewertung von Ringversuchsergebnissen gilt das 10- bis 50-fache der unteren Nachweisgrenze durchschnittlich sensitiver PCR-Protokolle unter Standardbedingungen (50 µl Block-Cycler Reaktionsansätze, 35 PCR-Zyklen, gegebenenfalls entsprechende real-time PCR-Protokolle mit 20 µl Reaktionsansatzvolumen; gut evaluierte Primersequenzen).

Bei den meisten Probenmaterialien der aktuellen Ringversuchsrunde stellen falsch-negative Ergebnisse damit einen deutlichen Hinweis auf ernstzunehmende Mängel innerhalb der eingesetzten Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion, Amplifikation und Detektion dar.

Falsch-positive Ergebnisse sind dagegen in der Regel als Hinweis auf eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung und/oder auf mangelnde Spezifität der eingesetzten Testsysteme zu betrachten.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Die Tabellen 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1]) zeigen dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert) mit den entsprechenden Codenummern der Ergebnisbögen. Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in den Tabellen 2 (siehe Anhang 1 [Anh. 1]) nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen, und in den Tabellen 3 (siehe Anhang 1 [Anh. 1]) nach der absoluten Anzahl der richtig positiven und richtig negativen Ergebnisse, sowie deren prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt.

Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

Auch im Rahmen des hier diskutierten Ringversuchs waren wieder einige Auffälligkeiten hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität von bestimmten Testkonzepten, und der für den Nachweis verwendeten Zielsequenzen, zu beobachten. Diese Aspekte sind bei der Auswertung des jeweiligen Ringversuchs aufgeführt und dort auch kurz diskutiert. Zusätzlich stehen für die früheren, für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe zusätzlicher Informationen (wie die graphisch dokumentierten Ergebnisse unserer quantitativen real-time PCR-Testsysteme oder die Ergebnisse einiger kommerzieller PCR-Testsysteme) auch unter folgender Internetadresse: http://www.udo-reischl.de; Unterpunkt „Auswertung der Ringversuche“ und natürlich auch über die Homepage von INSTAND e.V. (http://www.instandev.de/) als pdf-Files zum freien Download bereit.

An dieser Stelle möchte ich mich noch einmal ausdrücklich bei den geschätzten Kolleginnen und Kollegen für ihre zahlreichen und überaus konstruktiven Kommentare und Anregungen zu den Ausführungen in dieser Ringversuchsdiskussion sowie deren tatkräftige Unterstützung bei der Konzeption und dem Aufbau neuer Ringversuche bedanken.

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis und Gonokokken-Nachweis. Trotz der relativ geringen Erregermenge in den vier unterschiedlich zusammengesetzten positiven Proben führte auch diesmal die Verfügbarkeit gut evaluierter und zum Teil automatisierter NAT-gestützter Analysesysteme für Chlamydia trachomatis zu hohen Richtigkeitsquoten sowohl für positive, als auch für negative Befunde.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei Proben mit C. trachomatis (# 1425304 mit ~1x10⁴ IFU/mL und # 1425303, ~1x10⁵ IFU/mL), eine Probe (# 1425301) mit relativ geringen Mengen von ca. 1x10³ CFU/mL an N. gonorrhoeae, eine Probe (# 1425302) mit ca. 1x10⁴ CFU/mL an N. gonorrhoeae und eine Probe mit relativ hoher Menge an N. gonorrhoeae Zielorganismen (# 1425303; ~1 x10⁵ CFU/mL).

Der Übersichtlichkeit halber werden wir bei diesem kombinierten Ringversuch (CT/NG) die Ergebniskonstellation zukünftig in 7 getrennten Tabellen (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 1-3) darstellen. Damit wird die diagnostische Performance der jeweiligen Testsysteme beim Nachweis von CT und NG aussagekräftiger (Tabelle 4: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei CT, Tabelle 6: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei NG; jeweils gefolgt von den Richtigkeitsquoten nach aufgeführten Testsystemen in den Tabellen 5 und 7; siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 2-3).

Auch wenn die positive Proben # 1425304 des aktuellen Ringversuchs diesmal nur mit einer relativ geringen Menge an C. trachomatis-Zielorganismen versetzt worden war, fanden sich unter den von insgesamt 168 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis lediglich 3 falsch-negative Ergebnisse. Da von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei den falschen Ergebnissen vermutlich um Ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-Nachweises wurden für die Proben # 1425302 und # 1425303 (N. gonorrhoeae; ca. 1x10⁴ bzw. 1x10⁵ CFU/mL) diesmal nur von 2 der insgesamt 166 Teilnehmer falsch-negative bzw. als „fraglich“ klassifizierte Ergebnisse für Gonokokken DNA mitgeteilt. Überraschenderweise fanden sich bei der schwach-positiven Probe # 1425301 (N. gonorrhoeae; ca. 1x10³ CFU/mL) jedoch keine falsch-negativen Ergebnisse.

Bei der GO-negativen Probe # 1425304 wurden von 4 Teilnehmern je ein falsch-positives Ergebnis mitgeteilt. Dabei könnte es sich eventuell um ein sporadisches laborinternes Kontaminationsereignis bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion oder Testabarbeitung handeln. Angesichts der in einigen anamnestischen Konstellationen doch gravierenden Konsequenzen eines „überraschenden“ Gonokokken-Nachweises sollten falsch-positive Ergebnisse bei den betroffenen Ringversuchsteilnehmern Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer jeweiligen spezifischen NAT-gestützten Testsysteme geben.

Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen bleibt es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit bestimmten kommerziellen und komplett vorkonfektionierten Testsystemen die vorgegebenen Zielwerte nicht erreicht. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung, als auf intrinsische Unzulänglichkeiten, der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Ich glaube, es ist auch für den Leser dieser Ringversuchsdiskussion weitgehend nachvollziehbar, dass wir als Organisatoren von Testkonzept- und Testplattform-übergreifenden Ringversuchen bei der Konfektionierung unserer Probenmaterialien leider nicht jede Besonderheit im Abarbeitungsprotokoll von kommerziellen Testsystemen berücksichtigen oder unterschiedliche Arten von Ringversuchsprobenmaterial für bestimmte Testsysteme bereitstellen können.

Auf diesen Umstand wurde bereits bei früheren Ringversuchen mehrfach im Zusammenhang mit den RNA-Zielsequenzen der AMPLIFIED CT Testkits oder der APTIMA COMBO 2 Testkits (Hersteller: Gen-Probe Inc.) hingewiesen. Werden von Teilnehmern bestimmte NAT-Testsysteme eingesetzt, die erregerspezifische RNA-Zielsequenzen nachweisen oder auf einem RNA-basierten Amplifikationsprozess (TMA; Transcription-Mediated Amplification, o. ä.) beruhen, so kann mit dem hier versandten Probenmaterial offiziell keine regelgerechte Abprüfung der entsprechenden Sensitivitäten unter Routinebedingungen gewährleistet werden. Aber selbst wenn das Herstellungsverfahren unserer Ringversuchsproben primär nicht auf die Stabilisierung von RNA-Molekülen hin optimiert und getestet wurde, so konnten dennoch sowohl bei der aktuellen, wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchsrunden, von vielen Teilnehmern mit RNA-gestützten Testssystemen hohe Richtigkeitsquoten erzielt werden. Aktuell wurden die C. trachomatis-Zielorganismen von 5 und die Neisseria gonorrhoeae-Zielorganismen von allen 7 Teilnehmern mit RNA-basierten Gen-Probe Testsystemen erfolgreich nachgewiesen.

Entsprechende Inhibitionskontrollen wurden von allen 169 Teilnehmern durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt.

Mit nahezu allen kombinierten kommerziellen Testsystemen (wie Roche COBAS Amplicor, COBAS TaqMan, Becton Dickinson ProbeTec, Abbott RealTime CT/NG, Artus CT oder LightMix CT/NG) wurden insgesamt erfreulich hohe Richtigkeitsquoten sowohl für die positiven als auch für die negativen Ergebnisse beim spezifischen Nachweis von Chlamydien und Gonokokken beobachtet. Um eine detaillierter Bewertung der C. trachomatis- und GO-spezifischen NAT-Komponenten dieser kombinierten Testsysteme zu ermöglichen wurden diesmal zusätzlich die Tabellen 4 bis 7 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 2-3) angefertigt. In den Tabellen 4 und 5 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 2) sind dabei nur die C. trachomatis (CT)-spezifischen Ergebnisse und in den Tabellen 6 und 7 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 3) nur die Neisseria gonorrhoeae (GO)-spezifischen Ergebnisse dargestellt und statistisch ausgewertet.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“ bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Das aktuelle Ringversuchsset enthielt diesmal eine Probe mit ca. 1x10⁵ IFU/mL an C. trachomatis (# 1425312), eine Probe mit ca. 1x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 1425314), eine Probe mit ca. 5x10³ IFU/mL an C. trachomatis (# 1425311), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1425313), die ausschließlich nicht infizierte Zellen und Escherichia coli enthielten.

Wie Tab. 2 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 4) der statistischen Auswertung zu entnehmen ist, wurden von den insgesamt 103 Teilnehmern bei den drei positiven Proben überwiegend korrekte Ergebnisse mitgeteilt.

Von einem Teilnehmer wurden die Ergebnisse bei der negativen Probe # 1425313 als „fraglich“ klassifiziert. Bei den drei positiven Proben # 1425311, # 1425312 und # 1425314 sollten die falsch-negativen Ergebnisse bei den drei betroffenen Ringversuchsteilnehmern jedoch Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres DNA-Isolierungsprozesses bzw. des jeweiligen Chlamydia trachomatis-spezifischen NAT-gestützten Testsystems geben.

Die markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis-Zielorganismen kann, zumindest indirekt, erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme und der Probenabarbeitung angesehen werden.

Auch wenn mit ca. 5x10³ IFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme erreicht zu sein scheint, sollten bei Ringversuchsteilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität sowohl falsch-negative, als auch falsch-positive Ergebnisse Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Angesichts der nach wie vor anhaltenden Diskussion um das „Pooling“ von entsprechendem Untersuchungsmaterial bleibt der Aspekt der analytischen Sensitivität der jeweils eingesetzten Testsysteme bedeutsam.

Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten in-house-Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf hohem Niveau mit geringer statistischer Streuung.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine Probe mit hoher Menge an Zielorganismen (# 1425324; B. pertussis, ~1x10⁵ CFU/mL), eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella holmesii (# 1425321 mit 1x10⁵ CFU/mL), und eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella parapertussis (# 1425323 mit 1x10⁵ CFU/mL) als verwandten Spezies. Die Probe # 1425322 enthielt diesmal keine Zielorganismen, sondern lediglich E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen.

Die Verfügbarkeit von offensichtlich inzwischen sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemen für den Nachweis von Bordetella pertussis-DNA führte diesmal sowohl bei den positiven als auch bei den negativen Proben zu relativ hohen Richtigkeitsquoten.

Wie schon im letzten Ringversuch bereitete der spezifische Nachweis von Bordetella pertussis-DNA in der Probe # 1425324 den insgesamt 137 Teilnehmern keine allzu großen Schwierigkeiten. In der Probe # 1425324 mit einer Erregermenge von ~1x10⁵ CFU/mL durchwegs richtig-positive und keine falsch-negativen Ergebnisse berichtet.

Im RV 532 befand sich diesmal wieder ein IS481-positives Bordetella holmesii-Isolat, das (Methoden- bzw. Zielsequenz-bedingt) mit einigen B. pertussis-spezifischen NAT-Testsystemen kreuzreagierte. Die Aktualität dieser Problematik spiegelt sich beispielsweise in einer Veröffentlichung von Njamkepo et al. wider [2].

Insgesamt betrachtet scheint aber der Vorteil einer hochsensitiven Detektion von B. pertussis und B. holmesii über die Verwendung der repetitiven IS481-Zielsequenz die Nachteile einer (eher aus akademischer Sicht wünschenswerten) Differenzierungsmöglichkeit zwischen den beiden Spezies in der PCR-Routinediagnostik mehr als aufzuwiegen. Zudem scheint in unseren Breiten B. holmesii eher selten aufzutreten (siehe [3]) und Infektionen mit beiden Spezies scheinen eine gleichermaßen „behandlungsbedürftige“ Symptomatik hervorzurufen. Eine Abgrenzung zu den übrigen (IS481-negativen) Bordetella-Spezies muss jedoch aus diagnostischer Sicht stets gewährleistet sein (siehe Ringversuchsdiskussion April 2011).

Angesichts der sehr hohen Richtigkeitsquote für die B. pertussis-positive Probe # 1425324 und der technisch bzw. methodisch bei der Verwendung der IS481-Zielsequenz zu erwartenden Kreuzreaktion mit B. holmesii in Probe # 1425321 hat sich der Ringversuchsleiter in Abstimmung mit dem Sollwertlabor dazu entschlossen, bei der Erteilung der Zertifikate die falsch-positiven Ergebnisse bei B. holmesii nicht als falsch-negativ zu bewerten.

Die 4 Teilnehmer mit falsch-positivem Ergebnis bei der B. parapertussis-positiven Probe # 1425323 sollten jedoch intensiv daran arbeiten, die analytische Spezifität ihrer jeweiligen Testsysteme zu verbessern.

Im Rahmen der genaueren Auswertung der mitgeteilten Ergebnisse sollte der Vollständigkeit halber noch angemerkt werden, dass der RIDAGENE Borrelia PCR Testkit (r-biopharm) neben dem qualitativen Nachweis offenbar auch eine spezifische Differenzierung von B. pertussis, B. parapertussis und B. holmesii leisten kann. Von den entsprechenden Teilnehmern wurde hier zumindest durchwegs die korrekte Speziesinformation mitgeteilt.

Wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchen verwendete ungefähr die Hälfte der Teilnehmer (n=62) selbstentwickelte (in-house) Testsysteme oder auf dem Ergebnisformular nicht näher spezifizierte kommerzielle Testkits (n=34) mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von B. pertussis. In diesem Zusammenhang wurde von 46 Teilnehmern explizit die Verwendung der Insertionssequenz IS481, von 5 Teilnehmern die Verwendung des Pertussis-Toxin-Gens und von 2 Teilnehmern die Verwendung eines ribosomalen Gens als B. pertussis-spezifische Zielsequenz angegeben.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 6) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben in einer Art Verdünnungsreihe. Eine Probe mit einer sehr hohen Menge an Clarithromycin-resistenten H. pylori (# 1425331; ~5x10⁶ CFU/mL), eine mit ca. fünffach geringerer Menge (# 1425332; ~10⁵ CFU/mL), eine Probe mit ca. fünfzigfach geringerer Menge (# 1425334, ~10⁴ CFU/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1425333), die nur humanes Zellmaterial und E. coli enthielt.

Erfreulicherweise wurden alle drei H. pylori-haltigen Proben (# 1425331, # 1425332 und # 1425334) von allen Teilnehmern ausnahmslos als richtig-positiv bewertet und somit konnte diesmal eine eine globale Richtigkeitsquote von 100% erzielt werden. Wie bereits in den letzten Ringversuchen zeigte sich erneut die Verfügbarkeit gut evaluierter NAT-gestützter Analysesysteme mit hoher analytischer Sensitivität. Auch bei Probe # 1425333, die diesmal keine Helicobacter pylori-DNA enthielt sondern lediglich mit Escherichia coli K12 versetzt war, wurden keine falsch-positiven Ergebnisse beobachtet. Inhibitionskontrollen wurden von 46 der insgesamt 48 Teilnehmer durchgeführt, Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet. Sowohl die kommerziellen, als auch die eigenentwickelten Testsysteme schnitten im aktuellen Ringversuch wieder einmal erfreulich gut ab. So erreichten die in-house-Testsysteme wie auch die kommerziellen Assays eine Richtigkeitsqoute von 100%, was die richtig-positiven Ergebnisse betrifft. Auch bei den richtig-negativen Ergebnissen waren keine signifikanten Unterschiede in den Richtigkeitsquoten von in-house Testsystemen und kommerziellen Assays auszumachen.

Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori-Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen, innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs, mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 32 der insgesamt 38 Teilnehmer mitgeteilt, und die mitgeteilten Ergebnisse der molekularen Resistenztestung waren durchweg korrekt.

Wie auch bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr in dem Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Genen und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine Probe mit relativ hoher Menge eines EHEC:O157 Isolats (# 1425343; ca. 1x10⁵ CFU/mL; stx₁-, stx₂-, eae-, und hlyA-positiv), eine Probe mit etwas geringerer Menge dieses EHEC-Isolats (# 1425344, ~1x10⁴ CFU/mL) und eine Probe mit 1x10⁴ CFU/mL eines EPEC-Isolats (# 1425341; eae-positiv!). Probe # 1425342 enthielt einen E. coli K12 Stamm (eae- und hlyA-negativ).

Abgesehen von der etwas schwächer positiven EHEC-Probe # 1425344 (mit ca. 10⁴ CFU/mL) führte die Verfügbarkeit von mittlerweile bestens etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC hier durchwegs zu hohen Richtigkeitsquoten – sowohl für positive als auch für negative Befunde. Zudem waren in der aktuellen Runde des EHEC PCR-Ringversuchs auch keine Isolate mit „exotischen“ Varianten der Shiga-Toxin-Gene vertreten. Die beiden EHEC-positiven Proben # 1425343 und # 1425344 wurden problemlos von nahezu allen der insgesamt 116 Teilnehmer auch als solche erkannt und im Ergebnisformular als richtig-positiv berichtet. Die 5 Teilnehmer mit falsch-negativem Ergebnis für die etwas schwächer positive EHEC-Probe # 1425344 verwenden vermutlich Testsysteme mit geringerer analytischer Sensitivität oder verlieren etwas Sensitivität beim Aufschluss des Probenmaterials. Insgesamt gesehen sollte das aber nicht weiter schlimm sein, da in den meisten der teilnehmenden Laboratorien ein NAT-gestützter Nachweis von Shiga-Toxin-Genen im Umfeld der EHEC-Diagnostik primär als Kulturbestätigungstest eingesetzt wird. Bei zukünftigen Ringversuchen werden wir uns bemühen dass die meisten der positiven Proben wieder relativ hohe Mengen an Zielorganismen enthalten und der Schwerpunkt somit auf einer Abprüfung der analytischen Spezifität der eingesetzten Testsysteme liegt und weniger auf der dabei erzielten unteren Nachweisgrenze.

Die Probe # 1425342 (E. coli K12 Stamm, eae-, hlyA-negativ) wurde erfreulicherweise von allen Teilnehmern korrekt als negativ für EHEC/STEC berichtet.

Das EPEC-Isolat in Probe # 1425341 (E. coli K12 Stamm, eae-positiv, hlyA-negativ) wurde von 96 der insgesamt 116 Teilnehmer korrekterweise als negativ befundet. Von 18 der restlichen 19 Teilnehmer wurde hier jedoch ein positives PCR-Ergebnis für EHEC berichtet. Bei genauerer (visueller) Prüfung der jeweiligen Ergebnisbögen, der handschriftlichen Kommentare sowie der angegebenen Code-Nummern war aber rasch klar, dass es sich hier offenbar durchwegs um einen positiven PCR-Nachweis des eae-Gens (bei negativem PCR-Nachweis der stx-Gene) handelte.

Daher haben wir die Ergebnisse der 19 Teilnehmer methodisch und fachlich korrekt als „EPEC-positiv“ aber „EHEC-negativ“ umklassifiziert und es finden sich auch in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 7) bei dieser Probennummer keine falsch-positiven Ergebnisse mehr. Das eine als „fraglich“ klassifizierte Ergebnis bei Probe # 1425341 konnten wir auch nach Durchsicht des Ergebnisbogens nicht genauer auflösen.

Neben in-house Testsystemen werden zunehmend vorkonfektionierte kommerzielle Assays eingesetzt. In den Richtigkeitsquoten zeigte sich keine Über- bzw. Unterlegenheit eines Systems, was für die breite Etablierung PCR-/NAT-gestützter Testsysteme spricht. Zudem wurden von 101 Teilnehmern die differenzierten Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin-Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin(eae)- und/oder Enterohämolysin(hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest in dem mitgeteilten Umfang, großteils korrekt. Lediglich zwei Teilnehmer berichteten hier unkorrekte Ergebnisse.

Nachdem die Probenauswahl des letzten Ringversuchs mehr auf die analytische Spezifität der eingesetzten Testsysteme abzielte, wollten wir uns im aktuellen Ringversuch wieder einmal auf die Prüfung der analytischen Sensitivität fokussieren. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt somit eine Probe mit einer hohen Menge an Borrelia spielmanii (# 1425354, ~1x10⁵ Organismen/mL), eine Probe mit etwas geringerer Menge (# 1425353, ~1x10⁴ Organismen/mL), eine Probe mit relativ geringer Menge (# 1425351, ~1x10³ Organismen/mL) sowie eine Probe die eine relativ hohe Menge der Rückfallfieber (RF) Borrelie Borrelia turicatae enthielt (# 1425352, ~1x10⁴ Organismen/mL).

Nochmals eine kurze Rekapitulation zu B. burgdorferi sensu lato: Mittlerweile sind 21 verschiedene dem B. burgdorferi sensu lato-Komplex zugehörige, genetisch eindeutig unterscheidbare Spezies beschrieben. Unterschiede in den zur Diagnostik herangezogenen Zielgenen können bei z.T. erheblicher Inter- aber auch Intraspezies Heterogenität ein Problem für den PCR-/NAT-gestützten Nachweis darstellen. Gesichert humanpathogen und weit in Europa verbreitet sind B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii sowie die als neue Spezies akzeptierte B. bavariensis. Ebenfalls gesichert humanpathogen ist B. spielmanii, allerdings wurde diese Spezies bislang nur selten bei Erkrankungen (insbesondere Haut) oder in Zecken nachgewiesen. Als möglicherweise humanpathogen werden B. bissettii, B. lusitaniae und B. valaisiana eingestuft, alle in Europa nachgewiesen. Zu betonen ist auch die erhebliche genetische Heterogenität von B. garinii die allein für das OspA zumindest fünf serologisch und genetisch differenzierbare Typen in Europa zeigt.

B. turicatae dagegen ist den RF-Borrelien zuzurechnen und wird von einer Lederzecke – Ornithodoros turicata – übertragen. Die Relevanz dieser Spezifitätskontrolle ist in der auch in Deutschland regelhaft nachweisbaren RF-Borrelie B. miyamotoi begründet. Es darf betont werden, dass diese Borrelie durch die Schildzecke Ixodes ricinus übertragen wird – Hauptvektor für B. burgdorferi s.l. Teilnehmer, welche die nicht empfehlenswerte Untersuchung von vom Menschen entfernten Zecken auf B. burgdorferi s.l. anbieten und falsch-positive Ergebnisse mit B. turicatae erzielten, sollten sich zumindest um eine entsprechende Spezifizierung ihrer Methode bemühen.

Nach dieser knappen Auffrischung zu den Ringversuchsergebnissen: Die Detektion von Borrelia spielmanii in den Proben mit relativ hoher Erregerlast (# 1425353 mit ~1x10⁴ Organismen/mL bzw. # 1425354 mit ~1x10⁵ Organismen/mL) bereitete insgesamt wenig Probleme: die Quote richtig-positiver Ergebnisse war zwischen 99% und 97%. Bei abnehmender Erregerlast (~1x10⁴ Organismen/mL) wurde von zehn Teilnehmern ein falsch-negatives, von einem Teilnehmer ein fragliches Ergebnis berichtet. Dagegen war die Anzahl der Teilnehmer mit falsch-positivem (n=11) oder grenzwertigem (n=3) Ergebnis, entsprechend knapp 87% richtig negativen, mit ihren Borrelien-spezifischen PCR/NAT Testsystemen bei der negativen Probe # 1425352 doch insgesamt hoch.

Da diese Probe die mit B. burgdorferi s.l. eng verwandte RF-Borrelie Borrelia turicatae enthielt, ist eine Kreuzreaktion aufgrund mangelnder Spezifität des entsprechenden Testsystems bei dieser Konstellation sehr wahrscheinlich. Dabei darf noch einmal betont werden, dass mit B. miyamotoi auch RF-Borrelien zumindest in I. ricinus in Deutschland vorkommen, diese Spezifitätskontrolle somit einen durchaus realistischen Hintergrund hat. Laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung sind natürlich ebenfalls möglich und sollten ggf. kontrolliert und korrigiert werden.

Interne oder externe Inhibitionskontrollen wurden von 104 der 105 Teilnehmer mitgeführt und potentielle Inhibitionsereignisse wurden lediglich von zwei Teilnehmern bei einer Einzelprobe (?) des gesamten 4-er Sets mitgeteilt. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben.

Wie bei den vorhergehenden Ringversuchsrunden haben auch diesmal wieder ungefähr die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von Borrelien-DNA verwendet, kommerzielle Testsysteme wurden von 51 der 105 Teilnehmer eingesetzt. Im Großen und Ganzen waren im Rahmen dieses Ringversuchs auch keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den kommerziellen (Sensitivität durchschnittlich 98%) und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen (durchschnittliche Sensitivität ca. 94%) zu beobachten. Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen bleibt es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit bestimmten kommerziellen und komplett vorkonfektionierten Testsystemen die vorgegebenen Zielwerte nicht erreicht. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen (in der aktuellen Aussendung war dies bei 1 der 6 Demeditec GenFlow Assay Anwendern der Fall), zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung, als auf intrinsische Unzulänglichkeiten der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Wie schon beim letzten Mal hier vorab nochmals der Hinweis: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine sehr stark positive Probe # 1425364, die mit einer Menge von ca. 10⁶ CFU/mL an Legionella pneumophila-Serogruppe 5 versetzt war, sowie eine Probe mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1425361, ca. 10⁵ CFU/mL) an Legionella pneumophila-Serogruppe 5. Die Probe # 1425362 des aktuellen Sets enthielt ca. 10⁵ CFU/mL an Legionella dumoffii. Die zweite „negative“ Probe # 1425363 des aktuellen Probensets enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich E. coli.

Die beiden hoch positiven Proben des aktuellen Sets wurden erfreulicherweise von allen 97 Teilnehmer als negativ für Legionella pneumophila-DNA befundet. Zwei Teilnehmer berichteten ein falsch-positives Ergebnis und ein weiterer Teilnehmer ein fragliches Ergebnis. Da diese Probe lediglich E. coli-Zellen enthielt, ist eine Kreuzreaktion aufgrund mangelnder Spezifität des entsprechenden Testsystems bei dieser Konstellation sehr unwahrscheinlich. Vermutlich ist das falsch-positive Ergebnis hier durch laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung bedingt.

Die diesmal sehr stark positive Probe # 1425364 mit ca. 10⁶ CFU/mL an Legionella pneumophila SG5 wurde mit einer Ausnahme von allen 97 Teilnehmern korrekterweise als positiv berichtet. Die etwa 10-fach geringere Menge an Legionella pneumophila-Zielorganismen in Probe # 1425361 (ca. 10⁵ CFU/mL) konnte ebenfalls problemlos von fast allen Teilnehmern korrekt als positiv identifiziert werden. Ein Teilnehmer des aktuellen Legionella pneumophila PCR/NAT Ringversuchs berichtete bei drei der insgesamt 4 ausgesandten Proben ein als „fraglich“ klassifiziertes Ergebnis. Bei genauerer (visueller) Prüfung des entsprechenden Ergebnisformulars, der handschriftlichen Kommentare sowie der angegebenen Code-Nummern wurde aber deutlich dass dieser Teilnehmer lediglich ein Legionella spp. (genus-)spezifisches Nachweisverfahren verwendet hatte. Da die von ihm berichteten Ergebnisse hinsichtlich der Anwesenheit von Legionella spp. prinzipiell korrekt waren, wurde ein auf den „Nachweis von Legionella spp. auf Genusebene“ eingeschränktes Zertifikat erteilt.

Insgesamt sprechen die Ergebnisse für die gute Sensitivität der verwendeten Testsysteme, die allenfalls vereinzelt berichteten falsch-negativen Ergebnisse beruhen vermutlich eher auf anwendungstechnischen Problemen als auf unzureichender analytischer Sensitivität.

Die mit Legionella dumoffii (~1x10⁵ CFU/mL) versetzte Probe wurde von 88 Teilnehmern mit L. pneumophila-spezifischen PCR-/NAT-Testsystemen korrekterweise als negativ befundet. Acht Teilnehmer berichteten ein falsch-positives Ergebnis, was auf eine Kreuzreaktion bzw. mangelnde Speziesspezifität der Zielsequenz zurückzuführen sein dürfte.

Vor allem in-house real-time PCR Protokolle mit ribosomalen Zielsequenzen zeigten in der Vergangenheit immer wieder Probleme bei der Speziesspezifität. Bei Verwendung von nested Block-Cycler PCR-Protokollen zur Amplifikation von spezifischen Bereichen der 16S rDNA und anschließender DNA-Sequenzierung sollte jedoch der Fehler eher auf Anwenderseite gesucht werden (beispielsweise Kontaminationsereignisse bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung), da dieses Testkonzept in jedem Fall die Unterscheidung der Spezies erlauben sollte.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 47 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila-DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Signifikante Unterschiede bezüglich der analytischen Sensitivität zwischen kommerziellen und selbstentwickelten Testsystemen (von 50 Teilnehmern verwendet) fanden sich nicht. Inhibitionskontrollen wurden offenbar von 96 der 97 Teilnehmer durchgeführt, wobei von keinem der Teilnehmer ein signifikantes Inhibitionsereignis in den Einzelproben des aktuellen Probensatzes beobachtet wurde.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt eine Probe mit relativ hoher Menge an Salmonella enterica ser. Typhi (# 1425371; ~1x10⁵ CFU/mL), eine Probe mit dem gleichen Isolat in einer etwa zehnfach geringeren Menge (# 1425373; ~1x10⁴ CFU/mL), eine Probe mit Salmonella enterica ser. Grumpensis (# 1425372; ~1x10⁵ CFU/mL) sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1425374), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte diesmal bei 3 der 4 ausgesandten Proben des Ringversuchssets zu tadellosen Richtigkeitsquoten von 100%. Auch die schwächer positive Probe # 1425373 wurde von 14 der insgesamt 15 Teilnehmer korrekt als positiv befundet. In vorausgegangenen Ringversuchen war bei solch relativ niedrigen Erregerlasten immer wieder das eine oder andere falsch-negative Ergebnis berichtet worden.

Die Ergebnislage der aktuellen Aussendung unterstützt somit auch die analytische Sensitivität der eingesetzten Testsysteme.

Da in der aktuellen Ringversuchsrunde keine falsch-positiven Befunde mitgeteilt wurden, deutet dies, im Vergleich zu manchen der vorhergehenden Ringversuchsrunden, auch auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin, denn die negative Probe # 1425374 folgte diesmal unmittelbar nach den drei positiven Proben und wurde von keinem der 15 Teilnehmer als falsch-positiv getestet. Jeweils ca. die Hälfte der Teilnehmer verwendete kommerzielle bzw. selbstentwickelte Testsysteme.

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken. Daher werden gelegentlich auch andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe dieses Ringversuchs zu finden sein. Im aktuellen Ringversuch wurde jedoch eine Art Verdünnungsreihe von Listeria monocytogenes angefertigt, um primär die untere Nachweisgrenze der derzeit eingesetzten Testsysteme abzuprüfen. Probe # 1425381 enthielt eine relativ hohe Menge an L. monocytogenes (ca. 10⁵ CFU/mL), die auch von allen der insgesamt 31 Teilnehmer korrekt erfasst wurde. Probe # 1425384 enthielt mit ca. 10⁴ CFU/mL eine etwa zehnfach geringere Menge an Zielorganismen, die ebenfalls von allen Teilnehmern mit ihren jeweiligen spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert werden konnte. Mit ca. 10³ CFU/mL L. monocytogenes/mL Probenmaterial enthielt die Probe # 1425382 diesmal eine sehr geringe Menge der entsprechenden Zielorganismen. Erfreulicherweise konnte selbst diese schwach-positive Probe noch von 26 der insgesamt 31 Teilnehmer als „positiv“ klassifiziert werden. Lediglich 5 Teilnehmer berichteten hier ein negatives Ergebnis – vermutlich wurde in diesen Fällen ein Testsystem mit unzureichender analytischer Sensitivität verwendet.

Bei der Probe ohne Zielorganismen (# 1425383), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielten, wurde im Rahmen des aktuellen Ringversuchs von keinem der 31 Teilnehmer ein falsch-positives Ergebnis beobachtet. Im Vergleich zu den vorhergegangenen Ringversuchen deutet dies auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Hoffentlich bestätigt sich diese erfreuliche Beobachtung auch in den zukünftigen Ringversuchsrunden.

Da wir uns innerhalb dieses Ringversuchsprogramms gelegentlich auch mit einzelnen Proben an die derzeit technisch machbare untere Nachweisgrenze annähern wollen (Anmerkung: wir sind uns dabei sehr wohl bewusst, dass bei vielen Fragestellungen das „technisch machbare“ nicht unmittelbar gleichbedeutend mit dem „diagnostisch sinnvollen“ ist), bestand beim aktuellen Listerien-Ringversuch die diagnostische Herausforderung in der Abprüfung der analytischen Sensitivität individueller Testkonzepte. Der möglichst selektiven Detektion bzw. differenzierten Erfassung von non-monocytogenes Listerienspezies werden wir uns wieder in einigen der zukünftigen Ringversuchsrunden widmen.

Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit dem aktuellen Ringversuch auch wieder standardisierte Rückstellproben mit geringerer Menge an Zielorganismen zur Verfügung, die als untere Messlatte bezüglich der analytischen Sensitivität dienen können und direkt über den Ringversuchsleiter zu beziehen sind. Bei diesem Ringversuch besteht explizit die Option einer differenzierten Befundmitteilung. Hält ein Teilnehmer lediglich ein L. monocytogenes-spezifisches NAT-Verfahren vor, so kann er dies über den Zusatzcode [71] im Ergebnisfeld angeben und für die Erstellung des individuellen Zertifikats seitens INSTAND e.V. werden dann auch nur die L. monocytogenes-spezifischen Ergebnisse zur Bewertung herangezogen.

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasen- oder Wundabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostischen Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Nach den zugegebenermaßen etwas umfangreichen und ausführlichen Diskussionen der Ergebniskonstellationen vorhergegangener MRSA-Ringversuche kann die Auswertung des aktuellen Ringversuchs wieder einmal erfreulich kurz gehalten werden. Da wir diesmal, vielleicht abgesehen von einem aus vielerlei Hinsicht interessanten und vermutlich auch ziemlich einzigartigen MSSA-Isolats, keine besonders „schwierigen“ oder komplexen Probenkonstellationen versandt haben, wurden von den insgesamt 279 Teilnehmern mit ihren unterschiedlichsten NAT-gestützten Testsystemen nahezu durchweg korrekte PCR Ergebnisse für die insgesamt 4 Proben des aktuellen Panels berichtet.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) der statistischen Auswertung dargestellt, enthielt die Probe # 1425392 diesmal eine relativ hohe Menge eines Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (cMRSA; PVL-positiv; ~1x10⁵ CFU/mL), die Probe # 1425391 eine relativ hohe Menge eines sich genotypisch als MRSA, aber phänotypisch nach mehrfacher Austestung und umfangreicher Charakterisierierung als MSSA darstellendes S. aureus-Patientenisolat (S. aureus, ~1x10⁵ CFU/mL; mecA-positiv, PVL-negativ; spa:t1613), die Probe # 1425393 ein Methicillin-resistentes Staphylococcus epidermidis-Isolat (~5x10⁵ CFU/mL) und die Probe # 1425394 ein Methicillin-sensibles Staphylococcus epidermidis-Isolat (~1x10⁵ CFU/mL).

Erfreulicherweise wurden im aktuellen Ringversuch bei der positiven MRSA Probe # 1425392 von nahezu allen der 279 Teilnehmer durchweg korrekt positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt. Der technische oder methodische Hintergrund der 2 falsch-negativen Ergebnisse bei dieser Probe ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Möglicherweise wurden von diesen zwei Teilnehmern mit kommerziellen Testkits die entsprechenden Protokolle nicht präzise und vorgabengemäß abgearbeitet (was offenbar zu einer unzureichenden analytischen Sensitivität der PCR-Nachweisreaktionen führte) oder es ging während der Probenaufarbeitung ein gewisser Anteil der Template-DNA bei der DNA-Isolierung oder der Komplettierung der PCR-Ansätze verloren. Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen bleibt es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue verwunderlich, dass ein hoher Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit bestimmten kommerziellen und komplett vorkonfektionierten Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht, wogegen ein meist wesentlich geringerer Anteil dennoch daneben liegt. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen diese Zielwerte nicht erreichen, zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung, als auf intrinsische Unzulänglichkeiten, der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Bei der mit 1x10⁵ CFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1425392 den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Auch die beiden MRSA-negativen Proben # 1425393 und # 1425394 wurden von jeweils 276 bzw. 277 Teilnehmern mit ihren PCR-gestützten MRSA-spezifischen Testsystemen als „negativ“ getestet. Für die drei falsch-positiven Ergebnisse bei Probe # 1425393 (S. epidermidis-Patientenisolat, mecA positiv, ca. 5x10⁵ CFU/mL) bzw. das als „fraglich“ klassifizierte sowie das eine falsch-positive Ergebnis bei Probe # 1425394 (S. epidermidis-Patientenisolat, mecA negativ, ca. 1x10⁵ CFU/mL) hat der Ringversuchsleiter keine naheliegende Erklärung. Aufgrund der Probenreihenfolge im aktuellen Set (zweimal MRSA hoch positiv gefolgt von zwei MRSA-negativen Proben) könnte es sich hier durchaus um isoliert aufgetretene Kontaminationsereignisse mit MRSA DNA während der Probenaufarbeitung oder Amplifikation bzw. Detektion handeln. Aber solche „Ausreißer“ sind bei technisch aufwändigen Ringversuchen mit über 200 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen meines Erachtens keiner weiteren Diskussion. Insgesamt bleibt festzuhalten, dass der erfreulich große Anteil von richtig-negativen Befunden bei den MRSA-negativen Proben erneut für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminations- und Verschleppungsereignissen spricht.

Erwartungsgemäß wurden auch bei der „PCR- bzw genotypisch MRSA-positiven“ Probe # 1425391 von nahezu allen der 279 Teilnehmer durchweg „korrekt“ positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt. Hierbei handelt es sich um ein hochinteressantes S. aureus-Patientenisolat, das wir kollegialerweise für Ringversuchszwecke zur Verfügung gestellt bekommen haben. Hier ein kurzer Steckbrief: nach wiederholter Anzucht und multipler Subkultur einzelner S. aureus-Kolonien zum Ausschluss des Vorliegens einer möglichen Mischpopulation erwies sich dieses Isolat in der konventionellen Testung als Methicillin-sensibel. In der konventionellen Agglutination sowie mit einem qualitativen, immunchromatographischen Schnelltest ließ sich in dem S. aureus-Kulturisolat jedoch das Penicillin-bindende Protein 2a (PBP2a) zweifelsfrei nachweisen. Auf molekulargentischer Ebene erwies sich dieses besondere S. aureus-Isolat als positiv für das mecA-Gen (dieser Befund deckt sich mit dem Nachweis des mecA-Genprodukts PBP2a auf Proteinebene) sowie für die MRSA-typische SCCmec Kassette. Obwohl es sich hier aus kultureller Sicht lediglich um ein MSSA-Isolat handelt, sind auf Genomebene alle populären und in der Regel auch sehr zuverlässigen Markergene für MRSA vorhanden. Daher wurde der Zielwert im Rahmen des aktuellen PCR/NAT-Ringversuchs auf „genotypisch MRSA positiv“ gesetzt (Tabellen 2 und 3; siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 12).

Mit kollegialer Unterstützung der microBIOMix GmbH sind wir natürlich gerade dabei die Gesamtgenomsequenz dieses Isolats mittels next generation sequencing (NGS)-Technologien zu ermitteln und dann im direkten Vergleich zu anderen MRSA bzw. MSSA Gesamtgenomen auf Unterschiede oder zusätzliche Genelemente hin zu untersuchen.

Hier zeigt sich auf sehr eindrucksvolle Weise, dass selbst in dem bunten Spektrum der medizinischen Mikrobiologie – und hier speziell innerhalb des illustren Feldes der Bakterien – wieder einmal das gute alte bayerische Sprichwort gilt: „’s gibt nix wo’s ned gibt!“…

Der technische oder methodische Hintergrund der 2 falsch-negativen und dem einen als „fraglich“ klassifizierten Ergebnis bei dieser Probe ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Angesichts der mit 1x10⁵ CFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1425392, wie bereits zuvor bei Probe # 1425391 diskutiert, den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Insgesamt bleibt festzuhalten, dass der erfreulich große Anteil von richtig-positiven Ergebnissen, bei den beiden PCR-positiven Proben und die überwiegend richtig-negativen Befunde bei den beiden MRSA-negativen Proben, erneut für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminations- und Verschleppungsereignissen spricht. Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit den Proben dieses Ringversuchs wieder standardisierte Rückstellproben zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine-Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende (PVL-negative) Ergebnisse der molekularbiologischen PVL-Testung wurden von 61 der insgesamt 279 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt und alle Ergebnisse waren diesmal durchweg korrekt. Nähere Informationen zu der, nach wie vor hochaktuellen, cMRSA bzw. CA-MRSA Problematik finden sich beispielsweise in Linde und Lehn [4] oder Witte et al. [5]. Ein gut evaluiertes real-time PCR Protokoll für den gezielten Nachweis von PVL-positiven S. aureus-Isolaten findet sich beispielsweise in Reischl et al. [6]. Mittlerweile sind auch schon einige kommerzielle real-time PCR Testsysteme für den zuverlässigen molekulargenetischen Nachweis von PVL-Genen bei MRSA- und MSSA-Isolaten verfügbar (z.B. von r-biopharm oder von TIB Molbiol).

Eine wichtige Anmerkung wie immer vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine Probe mit einer relativ hohen Menge an entsprechenden Zielorganismen (# 1425401; Chlamydia pneumoniae, ~1x10⁵ IFU/mL) und eine Probe mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1425403; Chlamydia pneumoniae, ~1x10⁴ IFU/mL), eine Probe mit ca. ~1x10⁵ IFU/mL an Chlamydia trachomatis (# 1425404), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1425402), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Analog zu vorhergegangenen Ringversuchen wird bei der Auswertung der Ergebnisse auch diesmal die hervorragende analytische Sensitivität und Spezifität der gegenwärtig eingesetzten und z. T. auch bereits sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesysteme für den Nachweis von C. pneumoniae-DNA eindrucksvoll aufgezeigt. Aus den in der Tab. 2 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) aufgeführten Daten ist zu entnehmen, dass im aktuellen Ringversuch alle Teilnehmer die Zielorganismen in der positiven Probe # 1425401 (ca. 10⁵ IFU/mL) sicher und zuverlässig nachweisen konnten. Auch die zehnfach geringere Menge an Zielorganismen der Probe # 1425403 konnte von 112 der 113 Teilnehmer korrekt als positiv befundet werden.

Die beiden Proben ohne Zielorganismus (Probe # 1425404: C. trachomatis, ca. 10⁵ IFU/mL und # 1425402: Escherichia coli) wurden von der überwiegenden Mehrzahl der Teilnehmer korrekt als negativ befundet. Lediglich ein falsch-positives Ergebnis für die E. coli-haltige Probe sowie zwei falsch-positive Ergebnisse für die C. trachomatis-haltige Probe unterstreichen aufs Neue die hohe analytische Spezifität der eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zum Nachweis von C. pneumoniae-DNA. Bei den falsch-positiven Ergebnissen könnte es sich am ehesten um sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Kreuzreaktivitäten der C. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit DNA von E. coli oder C. trachomatis erscheinen eher als unwahrscheinlich. Selbstentwickelte in-house NAT-Testsysteme zur Detektion von C. pneumoniae-DNA wurden von 47 Labors eingesetzt, kommerzielle Assays wurden von 64 Teilnehmern verwendet. Aufgrund des leider noch relativ geringen Anteils und der nicht durchgehenden Spezifizierung von kommerziellen Testsystemen innerhalb des Teilnehmerfeldes lassen sich derzeit keine seriösen Vergleiche zwischen bestimmten kommerziellen Kits und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit führen.

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern der vergangenen Ringversuche hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut, wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial, konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben: Probe # 1425412 mit einer hohen Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁶ Genomkopien/mL) und Probe # 1425411 und # 1425413 mit einer etwa zehnfach geringeren Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁵ Genomkopien/mL). Probe # 1425414 enthielt ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Bis auf jeweils einen Ausreißer konnten die 128 Teilnehmer die DNA der M. pneumoniae-Zielorganismen in den Proben # 14125411, # 1425412 und # 1425413 problemlos und zuverlässig nachweisen. Für die mit E. coli versetzte „negative“ Probe # 1425414 wurde erfreulicherweise nur ein falsch-positive Ergebnis berichtet. Zugrundeliegen dürften diesem am ehesten eine laborinterne Kontamination bei der Probenextraktion und -abarbeitung. Insgesamt zeigt die Ergebniskonstellation in einem breiten Teilnehmerfeld mit unterschiedlichsten Testsystemen und PCR-Protokollen eine relativ hohe analytische Spezifität der eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zum Nachweis von M. pneumoniae-DNA.

Selbstentwickelte PCR-/NAT-Testsysteme kamen bei 54 Teilnehmern zum Einsatz, während die übrigen Teilnehmer kommerzielle Testsysteme verwendeten. Die Richtigkeitsquoten lagen bei in-house und vorkonfektionierten Assays jedoch auf vergleichbarem Niveau.

An dieser Stelle sei auch noch auf eine aktuelle Publikation der geschätzten Kollegen aus dem Konsiliarlabor für Mykoplasmen hingewiesen: Dumke und Jacobs [7].

Auch hier wieder eine Anmerkung vorweg: Der kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis „PCR/NAT Coxiella burnetii & Bacillus anthracis“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Coxiella burnetii- und Bacillus anthracis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Coxiella burnetii (~1x10³ Genomkopien/mL in Probe # 1425424 und ~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1425423), zwei Proben mit hundert-fach unterschiedlicher Menge an Bacillus anthracis-DNA (~1x10³ Genomkopien/mL in Probe # 1425424 und ~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 1425421), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1425422), die nur E. coli in einer Suspension aus humanen Zellen enthielt. Der Übersichtlichkeit halber haben wir uns bei diesem kombinierten Ringversuch entschlossen, die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen darzustellen: für Coxiella burnetii in den Tabellen 2 und 3 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) sowie für Bacillus anthracis in den Tabellen 4 und 5 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 16).

Coxiella burnetii: Wie bereits im vorausgegangenen Ringversuch gestaltet sich auch in der aktuellen Runde die Ergebnislage erfreulich einfach. Die Proben ohne den Zielorganismus (# 1425421 und # 1425422) wurden ausnahmslos korrekt als negativ bewertet. Die etwas stärker positive Probe # 1425423 mit ca. 10⁴ Genomkopien C. burnetii/mL wurde ebenfalls von allen Teilnehmern richtig klassifiziert, lediglich ein Teilnehmer scheiterte an der zweiten positiven Probe # 1425424 des Probesets mit einer etwa zehnfach geringeren Menge an C. burnetii (ca. 10³ Genomkopien/mL) und berichtete ein negatives Ergebnis. Auch wenn es sich möglicherweise nur um ein sporadisches Ereignis handelt, sollte ein falsch-negatives Ergebnis beim Nachweis eines L3-Erregers Anlass sein, das verwendete Testsystem sowie die Arbeitsabläufe sorgfältig zu prüfen, da die molekulare Diagnostik hier entscheidenden Einfluss auf das klinische Management eines Patienten nimmt.

Mit 19 diagnostischen Labors, welche in-house Testsysteme zum spezifischen Nachweis von C. burnetii verwenden, waren die selbstentwickelten Assays den vorkonfektionierten kommerziellen Testkits zahlenmäßig überlegen. Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von C. burnetii-DNA enthielten durchwegs eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Bacillus anthracis: Die Ergebnislage des Ringversuchs „Bacillus anthracis-DNA“ ist ebenfalls relativ schnell dargestellt: alle 17 Teilnehmer konnten mit ihren jeweils vor Ort etablierten Bacillus anthracis-spezifischen PCR/NAT-gestützten Testsystemen die beiden positiven Proben mit ca. 1x10⁵ Genomkopien/mL (# 1425421) und mit ca. 1x10³ Genomkopien/mL (# 1425424) an Bacillus anthracis-DNA erfolgreich nachweisen. Ebenfalls wurden von allen Teilnehmern korrekt negative Ergebnisse für die Proben ohne entsprechende Zielorganismen # 1425422 (nur E. coli in einer Suspension aus humanen Zellen) sowie # 1425423 (nur Coxiella burnetii mit ca. 10⁴ Genomkopien/mL in einer Suspension aus humanen Zellen) beobachtet. Wie im vorausgehenden Ringversuch wiederum eine sehr erfreuliche Gesamtsituation.

Zudem stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für C. burnetii-DNA und B. anthracis-DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Wiederum der Hinweis: Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Francisella tularensis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets können daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 17) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben: Probe # 1425433 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (F. tularensis spp. holarctica, ~1x10⁶ CFU/mL), Probe # 1425431 mit ca. zehnfach geringerer Menge (F. tularensis spp. holarctica, ~1x10⁵ CFU/mL) und Probe # 1425432 mit ca. ~1x10⁵ CFU/mL an F. tularensis spp. novicida. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (#1425434), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Alle Teilnehmer berichteten korrekte positive Ergebnisse für die Probe # 1425433, welche ca. 1x10⁶ CFU/mL des Zielorganismus enthielt. Die Proben mit etwa zehnfach geringerer Erregerlast (#1425431: 1x10⁵ CFU/mL F. tularensis spp. holarctica und # 1425432: 1x10⁵ CFU/mL F. tularensis spp. novicida) wurden von 18 der 19 Teilnehmer als positiv für den Zielorganismus berichtet. Die falsch-negative Bewertung sollte Anlass geben, die laborinternen Abläufe und das verwendete Testsystem bzgl. Sensitivität zu evaluieren und ggfs. zu optimieren. Technisch sollte die Detektion einer Erregerlast von 1x10⁵ CFU/mL sicherlich keine Probleme bereiten. Die Probe # 1425434, welche lediglich E. coli und humane Zellen enthielt, wurde von allen Teilnehmern korrekt als negativ gewertet. Insgesamt deckt sich die Ergebnislage weitgehend mit den Beobachtungen aus vorherigen Ringversuchen und spricht erneut für ein gutes Funktionieren sowohl der bei den jeweiligen Teilnehmern etablierten Testsysteme, als auch der implementierten laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen.

Der Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Carbapenemase-Gene“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zur molekularen Resistenztestung bzw. dem Direktnachweis von charakteristischen Carbapenemase-Genen aus DNA-Präparationen von Reinkulturen an Enterobacteriaceae konzipiert. Zum orientierenden Herantasten an die technische Eignung und die „Praktikabilität“ der versandten Probenmaterialien werden wir uns in den ersten Runden dieses methodisch anspruchsvollen Ringversuchs zur molekularen Resistenztestung auf die Abprüfung eines kleinen Spektrums der derzeit häufigsten Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae beschränken: KPC, VIM, OXA-48 ähnliche Gene, GES-Carbapenemasen NDM, IMP und GIM.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 18) der Auswertung dargestellt, enthielt das aktuelle Set drei Proben mit Carbapenem-resistenten Enterobacteriaceae: Probe # 1425441 enthielt Klebsiella pneumoniae Zielorganismen mit KPC-2 und VIM-26 Genen (ca. 1x10⁶ Genomkopien/mL), Probe # 1425443 enthielt Morganella morganii-Zielorganismen mit NDM-1 Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL) und Probe # 1425444 enthielt ein Klebsiella pneumoniae-Isolat mit OXA-48 Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL). Die vierte Probe # 1425442 war als eine Art von Negativkontrolle ausgelegt – sie enthielt lediglich E. coli ohne Carbapenemase-Gene.

Wie im vorausgehenden Ringversuch Frühjahr 2014 waren auch die Ergebnisse der aktuellen Runde sehr erfreulich. Alle 22 Teilnehmer erkannten sowohl die Proben # 1425441, # 1425443 und # 1425444 als positiv und wiesen so in ihren Testsytemen korrekterweise das Vorliegen einer Carbapenemase nach. Auch die Probe # 1425542, welche lediglich E. coli ohne Carbapenemase-Gene enthielt, wurde von allen teilnehmenden diagnostischen Laboratorien als negativ bewertet. Dies spricht unter anderem für ein hervorragendes Funktionieren von test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen. Gerade bei der molekularen Diagnosik von Carbapenemase-verdächtigen Enterobacteriaceae ist dies unbedingt erforderlich, da diese Befunde sowohl therapeutisch als auch aus Sicht der Krankenhaushygiene weittragende Konsequenzen zur Folge haben können.

Aufgrund der leider noch nicht durchgehenden Spezifizierung von kommerziellen Testsystemen innerhalb des Teilnehmerfeldes lassen sich derzeit keine seriösen Vergleiche zwischen bestimmten kommerziellen Kits und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit führen. Bezogen auf die individuell ermittelten Richtigkeitsquoten in Tab. 3 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 18) war die gesamte Ergebnislage bei diesem Ringversuch jedoch sehr gut.

Dieser im Jahr 2013 neu in unser Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch Nr. 560 „Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Zum orientierenden Herantasten an die unteren Nachweisgrenzen der im Anwenderkreis etablierten PCR/NAT-gestützten Testsysteme enthielt das aktuelle Set zwei positive Proben (Tab. 1; siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 19): eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1425601; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10⁴ Genomkopien/mL), eine Probe mit einer geringeren Menge (# 1425604; Pneumocystis jirovecii, ca. 1x10³ Genomkopien/mL) sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1425602 und # 1425603), aber mit E. coli und einer Suspension aus humanen Zellen.

Der Nachweis des Zielorganismus aus der stärker positiven Probe (# 1425601, ca. 1x10⁴ Genomkopien/mL) gelang 80 der 81 Teilnehmer. Das falsch-negative Ergebnis sollte bei dieser Erregermenge dem TN Anlass bieten, sein verwendetes Testsystem bezüglich der Sensitivität zu evaluieren und ggf. zu optimieren. Probe # 1425604 mit einer zehnfach geringeren Erregermenge wurde noch von 78 der 81 Teilnehmer korrekt als „positiv“ identifiziert. Bereits im vorausgehenden Ringversuch im Frühjahr 2014 war eine Probe mit vergleichbarer Erregermenge versendet worden, welche 75 der damals 84 Teilnehmer korrekt befundet haben. Einige der Teilnehmer scheinen somit unserem Aufruf, im Falle falsch-negativer Befunde die eingesetzten Testsysteme in ihrer Sensitivität zu evaluieren und zu optimieren, erfreulicherweise gefolgt zu sein. Für die Teilnehmer mit falsch-negativen Befunden in dieser Ringversuchsrunde bleibt unser Appell weiterhin bestehen, zumal eine Erregermenge von 1x10³ nicht als „äußerst gering“ einzuschätzen ist.

Bei den Proben ohne Zielorganismen (# 1425602 und # 1425603), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielten, wurden im Rahmen des aktuellen Ringversuchs von 2 (# 1425602) bzw. 3 (# 1425603) Teilnehmern falsch-positive Ergebnisse berichtet (Tab. 2; siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 19). Dies legt ein laborinternes Kontaminationsereignis oder eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe und sollte eine sorgfältige Aufarbeitung nach sich ziehen. Andererseits sprechen die mehrheitlich richtig-negativen Ergebnisse für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen im Teilnehmerkreis. Alle eingesetzten Testsysteme wiesen Inhibitionskontrollen auf, eine nennenswerte Inhibition wurde von keinem der Teilnehmer berichtet.

Wie gehabt möchten wir uns an dieser Stelle recht herzlich bei allen Kollegen in den zahlreichen nationalen und internationalen Sollwertlaboratorien sowie bei den Kollegen und Mitarbeitern in Jena, Salzburg, Hamburg, Oberschleißheim, Bonn, Dresden, München, Berlin, Bochum und Regensburg bedanken, die nach wie vor hochmotiviert an der praktischen Umsetzung unseres gemeinsamen Vorhabens zur externen Qualitätssicherung mitarbeiten.

Zugleich hoffen wir weiterhin auf rege Teilnahme und einen reibungslosen Ablauf der zukünftigen Ringversuchsrunden.