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Nach erfolgreicher Etablierung dieser neuen Ringversuchs-Serie wollen wir hier auch für Kolleginnen und Kollegen, die bisher noch nicht an diesen Ringversuchen teilgenommen haben, die Ergebnisse der aktuellen Ringversuche für den NAT-gestützten Nachweis von Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, EHEC/STEC, Borrelia burgdorferi sensu lato, Legionella pneumophila, Salmonella enterica und Listeria spp., MRSA bzw. cMRSA, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetti, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Pneumocystis jirovecii (vorm. P. carinii) sowie dem neu ins Programm aufgenommenen Ringversuch zur molekularen Resistenztestung für Carbapenemase-Gene bei Enterobacteriaceae darstellen und kurz diskutieren.

Für nähere Informationen über die Zusammensetzung der Ringversuchsproben, dem Sinn und Zweck dieser neuen Möglichkeit zur externen Qualitätskontrolle im Umfeld der Nukleinsäurediagnostik sowie zu den Eckdaten unseres flexiblen Ringversuchskonzepts sei hier auf unsere initiale Veröffentlichung in der Zeitschrift „Der Mikrobiologe“ [1] verwiesen. Gerne werden wir hier auch weiterhin in regelmäßigen Abständen und in ähnlicher Form über die Ergebnislage, Auswertung und Analyse unser zukünftigen Ringversuche berichten.

Wie bei allen anderen Ringversuchen erfolgt die Anmeldung zu ausgewählten Teilen der Reihe „Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis (PCR/NAT)“ über die Gesellschaft zur Förderung der Qualitätssicherung in Medizinischen Laboratorien (INSTAND e.V.), Düsseldorf (http://www.instandev.de/). Nach Abschluss des jeweiligen Ringversuchs werden die Ergebnisse der einzelnen Teilnehmer dort zentral erfasst und anhand von individuellen Bewertungskriterien werden die schriftlichen Zertifikate erstellt. Zusätzlich stehen für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe weiterer Informationen auch im Internet unter http://www.udo-reischl.de/, Unterpunkt „INSTAND-Ringversuche (PCR/NAT)“ sowie auf der Homepage von INSTAND e.V. als pdf-Files zum freien Download bereit.

Neben der Aussendung von lyophilisierten Probenmaterialien zur systematischen Abprüfung von NAT-gestützten Testsystemen für derzeit 16 unterschiedliche bakterielle und fungale Zielorganismen bzw. Pathogenitätsfaktoren gab es im Rahmen dieser Ringversuchsrunde auch wieder gewisse „Highlights“: so wurde beispielsweise im aktuellen RV 532 Bordetella pertussis eine Probe mit der zum Zielorganismus verwandten Spezies Bordetella holmesii versandt, die ebenfalls das populäre Zielgen IS481 enthält und daher von vielen unserer Ringversuchsteilnehmer als PCR-positiv getestet wurde. Als weiteres „Highlight“ innerhalb der aktuellen Ringversuchsrunde wurde in einer der 4 Einzelproben des RV 539 MRSA/cMRSA ein mecC-positives MRSA-Isolat ausgesandt, das erwartungsgemäß nur von einigen Teilnehmern mit speziell auf dieses „neue“ Methicillin-Resistenzgen abgestimmten Testsystemen detektiert werden konnte. Auch wenn solche mecC-positiven MRSA-Isolate derzeit zumindest in unseren Breiten noch sehr selten nachgewiesen werden, so soll mit der Mitführung dieses Isolats bei den Teilnehmern und innerhalb der Leserschaft dieser Ringversuchsdiskussion zumindest das Bewusstsein für das mögliche Vorkommen solcher mecC-positiven MRSA-Isolate geweckt werden. Derzeit beschränkt sich der Nachweis von mecC-positiven MRSA-Isolaten (methoden- oder prävalenzbedingt?) noch auf einige wenige Einzelfälle. Inwieweit jedoch die Entwicklung und das zusätzliche Mitführen von mecC-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen erforderlich sein wird, kann sich erst im Rahmen zukünftiger systematischer Prävalenzstudien zeigen.

Nach dem offenbar sehr erfolgreichen Verlauf der aktuellen Proberingversuchs-Runde wird der neue RV 544 zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von Carbapenemase-Genen bei Enterobacteriaceae in das reguläre Ringversuchsprogramm „Bakteriengenom-Nachweis PCR/NAT“ von INSTAND e.V. aufgenommen und zukünftig halbjährlich angeboten. Zumindest in der Anfangsphase dieses methodisch anspruchsvollen Ringversuchs zur molekularen Resistenztestung werden wir uns auf das Spektrum der derzeit häufigsten Carbapenemase Gene beschränken: KPC, VIM, OXA-48, GES Carbapenemase, NDM, IMP und GIM. An der Ringversuchsleitung wird unser geschätzter Kollege Dr. Martin Kaase vom Nationalen Referenzzentrum für Gram-negative Krankenhauserreger, Abteilung für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr Universität in Bochum maßgeblich beteiligt sein.

Alle Teilnehmer sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt.

In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit relativ geringer Menge folgender Zielorganismen: Chlamydia trachomatis (Probe # 1415312), Borrelia burgdorferi (Probe # 1415351), Chlamydia pneumoniae (Probe # 1415403), Coxiella burnetii (Probe # 1415424), Francisella tularensis (Probe # 1415433) sowie Pneumocystis jirovecii (Probe # 1415601). Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze, u. a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker, für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen.

An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind, und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Mit Ausnahme der zuvor erwähnten „grenzwertig positiven“ Einzelproben wurden die Mengen der entsprechenden Zielorganismen in den Probensätzen der aktuellen Ringversuchsrunde wieder relativ deutlich über der Nachweisgrenze von „durchschnittlich sensitiven PCR/NAT-Testkonzepten“ eingestellt. Diese definieren wir wie folgt: als Richtwert für die Bewertung von Ringversuchsergebnissen gilt das 10- bis 50-fache der unteren Nachweisgrenze durchschnittlich sensitiver PCR-Protokolle unter Standardbedingungen (50 µl Block-Cycler Reaktionsansätze, 35 PCR-Zyklen, ggf. entsprechende real-time PCR Protokolle; gut evaluierte Primersequenzen).

Bei den meisten Probenmaterialien der aktuellen Ringversuchsrunde stellen falsch-negative Ergebnisse damit einen deutlichen Hinweis auf ernstzunehmende Mängel innerhalb der eingesetzten Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion, Amplifikation und Detektion dar.

Falsch-positive Ergebnisse sind dagegen in der Regel als Hinweis auf eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung und/oder auf mangelnde Spezifität der eingesetzten Testsysteme zu betrachten.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Die Tabellen 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1]) zeigen dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert) mit den entsprechenden Codenummern der Ergebnisbögen. Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in den Tabellen 2 (siehe Anhang 1 [Anh. 1]) nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen, und in den Tabellen 3 (siehe Anhang 1 [Anh. 1]) nach der absoluten Anzahl der richtig positiven und richtig negativen Ergebnisse sowie deren prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt.

Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

Auch im Rahmen des hier diskutierten Ringversuchs waren wieder einige Auffälligkeiten hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität von bestimmten Testkonzepten, und der für den Nachweis verwendeten Zielsequenzen, zu beobachten. Diese Aspekte sind bei der Auswertung des jeweiligen Ringversuchs aufgeführt und dort auch kurz diskutiert. Zusätzlich stehen für die früheren, für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe zusätzlicher Informationen (wie die graphisch dokumentierten Ergebnisse unserer quantitativen real-time PCR-Testsysteme oder die Ergebnisse einiger kommerzieller PCR-Testsysteme) auch unter folgender Internetadresse: http://www.udo-reischl.de; Unterpunkt „Auswertung der Ringversuche“ und natürlich auch über die Homepage von INSTAND e.V. (http://www.instandev.de/) als pdf-Files zum freien Download bereit.

Wie gehabt möchten wir uns an dieser Stelle recht herzlich bei allen Kollegen in den zahlreichen nationalen und internationalen Sollwertlaboratorien sowie bei den Kollegen und Mitarbeitern in Jena, Salzburg, Hamburg, Oberschleißheim, Bonn, Dresden, München, Berlin, Bochum und Regensburg bedanken, die nach wie vor hochmotiviert an der praktischen Umsetzung unseres gemeinsamen Vorhabens zur externen Qualitätssicherung mitarbeiten.

Zugleich hoffen wir weiterhin auf rege Teilnahme und einen reibungslosen Ablauf der zukünftigen Ringversuchsrunden.

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis und Gonokokken-Nachweis. Trotz der relativ geringen Erregermenge in den vier unterschiedlich zusammengesetzten positiven Proben führte auch diesmal die Verfügbarkeit gut evaluierter und zum Teil automatisierter NAT-gestützter Analysesysteme für Chlamydia trachomatis zu hohen Richtigkeitsquoten sowohl für positive, als auch für negative Befunde.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei Proben mit relativ geringen Mengen an C. trachomatis (# 1415301 und # 1415304, ~1x10⁴ IFU/mL), eine Probe (# 1415304) mit ca. 1x10⁴ CFU/mL an N. gonorrhoeae und eine Probe mit 10-fach höherer Menge an N. gonorrhoeae Zielorganismen (# 1415303; ~1 x10⁵ CFU/mL).

Der Übersichtlichkeit halber werden wir bei diesem kombinierten Ringversuch (CT/NG) die Ergebniskonstellation zukünftig in 7 getrennten Tabellen (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 1-3) darstellen. Damit wird die diagnostische Performance der jeweiligen Testsysteme beim Nachweis von CT und NG aussagekräftiger (Tab. 4: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei CT, Tab. 6: Übersichtsdarstellung der Ergebnislage bei NG; jeweils gefolgt von den Richtigkeitsquoten nach aufgeführten Testsystemen in den Tab. 5 und 7; siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 2-3).

Auch wenn die beiden positiven Proben # 1415301 und # 1415304 des aktuellen Ringversuchs diesmal nur mit einer relativ geringen Menge an C. trachomatis-Zielorganismen versetzt worden waren, fanden sich unter den von insgesamt 194 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis lediglich 2 falsch-positive und 5 falsch-negative Ergebnisse. Da von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchweg korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei den falschen Ergebnissen vermutlich um ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-Nachweises wurden für die Proben # 1415303 und # 1415304 (N. gonorrhoeae; ca. 1x10⁵ bzw. 1x10⁴ CFU/mL) diesmal nur von 2 der insgesamt 192 Teilnehmer falsch-negative Ergebnisse für Gonokokken-DNA mitgeteilt. Bei den beiden GO-negativen Proben wurden ebenfalls nur von 2 Teilnehmern je ein falsch-positives Ergebnis mitgeteilt.

Angesichts der mit 1x10⁴ bis 1x10⁵ CFU/mL ehrlicherweise nicht als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an beiden Zielorganismen in den Proben # 1415301, # 1415303 und # 1415304 sollten falsch-negative Ergebnisse bei betroffenen Ringversuchsteilnehmern Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer jeweiligen spezifischen NAT-gestützten Testsysteme geben.

Um eine detaillierter Bewertung der C. trachomatis- und GO-spezifischen NAT-Komponenten dieser kombinierten Testsysteme zu ermöglichen wurden diesmal zusätzlich die Tab. 4 bis 7 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 2-3) angefertigt. In den Tab. 4 und 5 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 2) sind dabei nur die C. trachomatis (CT)-spezifischen Ergebnisse und in den Tab. 6 und 7 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 3) nur die Neisseria gonorrhoeae (GO)-spezifischen Ergebnisse dargestellt und statistisch ausgewertet.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“ bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Im handschriftlichen Kommentarfeld der Ergebnisformulare wurden unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Mikrogen Diagenode N. gonorrhoeae Real Time PCR kit (5x), HAIN Lifescience GenoQuick CT (4x), HAIN Lifescience FluoroType CT (4x), HAIN Lifescience FluoroType NG (4x), TIB Molbiol LightMix N. gonorrhoeae (4x), GeneProof C. trachomatis PCR Kit (4x), GeneProof N. gonorrhoeae PCR Kit (5x), Roche Cobas 4800 System (3x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (3x), BD ProbeTec (3x), Mikrogen Diagenode C. trachomatis Real Time PCR kit (3x), Artus C. trachomatis (2x), Artus N. gonorrhoeae (2x), Amplex Hyplex STD Chlamydia und Neisseria (2x), Urethritis basic von fast-track Diagnostics (2x), Abbott RealTime CT/NG (1x), AmpliSens C. trachomatis/N. gonorrhoeae PCR Kit (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID STD Kit (1x), N. gonorrhoeae Amplex Multiplex ELISA (1x), BioRad Dx CT/NG/MG Assay (1x), Medac/Goffin CT/NG Assay (1x), Euroclone Duplica Real Time C. trachomatis (1x), Euroclone Duplica Real Time N. gonorrhoeae (1x), Bioron RealLine C. trachomatis/N. gonorrhoeae (2x), AmpliGnost C. trachomatis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), Surefood CT/NG triplex von Congen (1x), Sacace N. gonorrhoeae Real-TM (1x), Sacace C. trachomatis Real-TM (1x), Seegene Anyplex™ STI-7 Detection (2x) und Seegene Seeplex STI Master Panel1 (1x).

Unabhängig von der Art des verwendeten Testsystems soll in diesem Zusammenhang auch noch einmal darauf hingewiesen werden, dass in Gegenwart von relativ hohen Mengen an Zielorganismen (bzw. deren Nukleinsäure) die interne Kontrollreaktion aufgrund der „Konkurrenzsituation“ mit der Amplifikation der eigentlichen Zielsequenz durchaus negativ ausfallen kann, obwohl keine Inhibition der PCR-Reaktion im eigentlichen Sinne vorliegt.

Das aktuelle Ringversuchsset enthielt diesmal eine Probe mit ca. 1x10⁴ IFU/mL an C. trachomatis (# 1415311), eine Probe mit ca. 5x10³ IFU/mL an C. trachomatis (# 1415312) sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1415313 und # 1415314), die ausschließlich nicht infizierte Zellen und Escherichia coli enthielten.

Wie Tab. 2 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 4) der statistischen Auswertung zu entnehmen ist, wurden von den insgesamt 125 Teilnehmern bei den zwei positiven Proben überwiegend korrekte Ergebnisse mitgeteilt.

Von je einem Teilnehmer wurden die Ergebnisse bei den beiden negativen Proben # 1415313 und # 1415314 als „fraglich“ klassifiziert. Bei den beiden negativen Proben # 1415313 und # 1415314, die ausschließlich nicht infizierte Humanzellen und Escherichia coli enthielt, sollten die falsch-positiven Ergebnisse bei den zwei betroffenen Ringversuchsteilnehmern jedoch Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres DNA-Isolierungsprozesses bzw. des jeweiligen Chlamydia trachomatis-spezifischen NAT-gestützten Testsystems geben.

Die markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis-Zielorganismen kann, zumindest indirekt, erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme und der Probenabarbeitung angesehen werden.

Auch wenn mit ca. 1x10³ IFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme erreicht zu sein scheint, sollten bei Ringversuchsteilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität sowohl falsch-negative, als auch falsch-positive Ergebnisse Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Angesichts der nach wie vor anhaltenden Diskussion um das „Pooling“ von entsprechendem Untersuchungsmaterial bleibt der Aspekt der analytischen Sensitivität der jeweils eingesetzten Testsysteme bedeutsam.

Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten in-house-Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchweg auf hohem Niveau mit geringer statistischer Streuung.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. folgende Testsysteme aufgeführt: HAIN Lifescience FluoroType CT (6x), GeneProof C. trachomatis PCR Kit (4x), VERSANT CT DNA Assay von Siemens (2x), Autoimmun Diagnostika Gen ID STD Kit (1x), Mikrogen Diagenode C. trachomatis Real Time PCR kit (1x), Bioron C. trachomatis PCR (1x), Minerva biolabs Onar CT qPCR (1x), Sacace C. trachomatis Real-TM (1x) und AmpliGnost C. trachomatis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine Probe mit hoher Menge an Zielorganismen (# 1415321; B. pertussis, ~5x10⁵ CFU/mL), eine mit etwas geringerer Menge (# 1415323; B. pertussis ~1x10⁴ CFU/mL) sowie eine Probe mit einem klinischen Isolat von Bordetella holmesii als verwandte Spezies (# 1415324 mit 5x10⁵ CFU/mL). Die Probe # 1415322 enthielt diesmal keine Zielorganismen, sondern lediglich E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen.

Wie schon im letzten Ringversuch bereitete der Nachweis von Bordetella pertussis-DNA in den Proben # 1415321 und # 1415323 den Teilnehmern keine allzu großen Schwierigkeiten. In der Probe #1415321 mit einer Erregermenge von ~5x10⁵ CFU/mL wurden lediglich zwei falsch-negative Ergebnisse berichtet. Allerdings wurden für die Probe # 1415323 (Erregermenge ~1x10⁴ CFU/mL) neun falsch-negative und ein fragliches Ergebnis berichtet. Bei einer Menge von 10⁴ CFU/mL an B. pertussis-Zielorganismen (entspricht ca. 10³ CFU in dem für PCR-Untersuchungen typischerweise prozessierten Probenvolumen von 100 µL) liegt man deutlich über den in früheren Ringversuchsrunden beobachteten unteren Nachweisgrenzen entsprechender PCR-Testsysteme. In der mikrobiologischen Praxis sind vor allem bei Rachenabstrichen gelegentlich auch geringe Erregermengen zu erwarten – daher sollten falsch-negative Ergebnisse bei dem betroffenen Teilnehmer durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung seines jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Erfreulicherweise wurde von keinem Teilnehmer die mit Escherichia coli K12 versetzte Probe #1415322 als positiv für Bordetella pertussis eingestuft, es wurden ausnahmslos richtig-negative Ergebnisse vermerkt.

Auffällig war beim aktuellen Ringversuch eine hohe Rate an „falsch-positiven“ Ergebnissen für die Probe # 1415324, die diesmal nennenswerte Mengen an Bordetella holmesii enthielt. Wie bereits bei vorhergegangenen Ringversuchen erwähnt, ist diese Kreuzreaktion bei der Verwendung von IS481 als „B. pertussis-spezifische“ Zielsequenz jedoch ganz einfach zu erklären. Auf dem Genom aller bisher untersuchten B. holmesii-Isolate befinden sich einige Kopien der bakteriellen Insertionssequenz IS481. Kopien der Insertionssequenz IS481wurden auch gelegentlich bei B. bronchiseptica gefunden. Dieser Umstand führte bei 113 der 152 Teilnehmer zwangsläufig zu „falsch-positiven“ PCR-Ergebnissen für die Probe # 1415324. Die Inzidenz von B. holmesii und B. bronchiseptica in klinischen Materialien von Menschen dürfte jedoch (zumindest hierzulande) eher gering sein. Daher erscheint es auch vertretbar, die Sequenz IS481, für die eine Vielzahl von Validierungsdaten vorliegt, auch weiterhin zur NAT-gestützten Diagnostik einer Infektion mit B. pertussis einzusetzen. Im Rahmen dieses Ringversuchs wollten wir aber lediglich auf diese potentielle Kreuzreaktion aufmerksam machen und bei Verwendung der IS481-Zielsequenz wurde ein positives Ergebnis für Probe # 1415324 daher nicht als Fehler bewertet. Zudem wurde diese unausweichliche Kreuzreaktion nicht bei der Berechnung der Richtigkeitsquoten für die negativen Ergebnisse berücksichtigt (Tab. 3, siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 5). Inhibitionskontrollen wurden von 150 der insgesamt 152 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchen verwendete die überwiegende Anzahl der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme (63 Teilnehmer) oder auf dem Ergebnisformular nicht näher spezifizierte kommerzielle Testkits mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen (89 Teilnehmer) zum NAT-gestützten Nachweis von B. pertussis.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: r-biopharm RIDA GENE Bordetella Real Time PCR (10x), Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP B. pertussis (5x), GeneProof B. pertussis/parapertussis PCR Kit (8x), AmpliGnost B. pertussis/parapertussis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (5x), ARGENE Bordetella R-gene (2x), Mikrogen Diagenode B. pertussis/B. parapertussis kit (2x), Seegene PneumoBacter ACE Detection (1x), Attomol Bordetella-Realtime LT (1x), Ingenetix BactoReal Bordetella pertussis (2x), fast-track Diagnostics Bordetella (1x) und Bordetella Real-TM von Sacace (1x).

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 6) dargestellt, enthielt Probe # 1415331 des aktuellen Ringversuchs eine relativ hohe Menge an Clarithromycin-sensiblen H. pylori (~10⁵ Organismen/mL). Die Probe # 1415332 enthielt das gleiche Isolat in einer etwa zehnfach geringeren Menge (~10⁴ CFU/mL). Probe # 1415333 enthielt eine Kultursuspension der Spezies Helicobacter mustelae (~ 1x10⁵ CFU/mL) und Probe # 1415334 ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Erfreulicherweise wurden beide H. pylori-haltigen Proben (# 1415331 und # 1415332) von allen Teilnehmern ausnahmslos als richtig-positiv bewertet und somit eine Richtigkeitsquote von 100% erzielt. Wie bereits in den letzten Ringversuchen zeigte sich erneut die Verfügbarkeit gut evaluierter NAT-gestützter Analysesysteme mit hoher analytischer Sensitivität. Im aktuellen Ringversuch wurde zudem die analytische Spezifität der verwendeten Testsysteme durch die Probe # 1415333 überprüft, welche mit Helicobacter mustelae (~1x10⁵ CFU/mL) eine „non-pylori“ Helicobacter-Spezies enthielt. Für diese Probe wurden vier falsch-positive Ergebnisse berichtet sowie ein fragliches Ergebnis. Ein falsch-positives Ergebnis sollte zum Anlass genommen werden, die Speziesspezifität des verwendeten Testsystems zu überprüfen. Die Probe #1415334 enthielt diesmal keine Helicobacter pylori-DNA, sondern war lediglich mit Escherichia coli K12 versetzt. Diese Probe wurde fälschlicherweise von einem Teilnehmer als positiv gewertet. Hier liegt möglicherweise ein laborinternes Kontaminationsereignis zugrunde und sollte eine Überprüfung der Arbeitsabläufe und ggfs. auch des verwendeten Testsystems nach sich ziehen. Inhibitionskontrollen wurden von 46 der insgesamt 48 Teilnehmer durchgeführt, Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet.

Sowohl die kommerziellen, als auch die eigenentwickelten Testsysteme schnitten im aktuellen Ringversuch wieder einmal erfreulich gut ab. So erreichten die in-house Testsysteme wie auch die kommerziellen Assays eine Richtigkeitsqoute von 100%, was die richtig-positiven Ergebnisse betrifft. Auch bei den richtig-negativen Ergebnissen waren keine signifikanten Unterschiede in den Richtigkeitsquoten von in-house Testsystemen und kommerziellen Assays auszumachen.

Bis auf 25 Teilnehmer mit kommerziellen Testsystemen (im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ 1 x Geno Sen’s Helicobacter pylori von Genome Diagnostics und 1 x RIDA GENE Helicobacter von r-biopharm, angegeben) verwendeten die Teilnehmer zum NAT-gestützten Nachweis von H. pylori selbstentwickelte, sog. in-house Testsysteme.

Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori-Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen, innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs, mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 37 der insgesamt 48 Teilnehmer mitgeteilt, und mit Ausnahme eines einzigen Teilnehmers waren die mitgeteilten Ergebnisse der molekularen Resistenztestung auch durchweg korrekt.

Wie auch bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr in dem Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Genen und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher zwei unterschiedliche, aber relativ stark EHEC positive Proben mit ca. 1x10⁵ CFU/mL (# 1415342: E. coli, stx₁-, und eae-positiv und # 1415344: E. coli, stx₁-, stx₂-, eae-, hlyA- und O157-positiv) und eine Probe mit 1x10⁵ CFU/mL an Salmonella enterica ser. Typhi (# 1415341). Probe # 1415343 enthielt einen E. coli K12 Stamm (eae-, hlyA-negativ).

In diesem Ringversuch waren keine „exotischen“ Shiga-Toxin-Gene vertreten, sodass, begründet auf die Verfügbarkeit von mittlerweile bestens etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC, bei allen Proben durchwegs hohe Richtigkeitsquoten – sowohl für positive als auch für negative Befunde – verzeichnet werden konnten. Die beiden EHEC-haltigen Proben # 1415342 bzw. 1415344 wurden von 130 bzw. 132 Teilnehmern als richtig-positiv berichtet. Eine naheliegende Erklärung für die zwei falsch-negativen sowie ein fragliches Ergebnis der stx₁-, und eae-positiven Probe # 1415342 gibt es ebensowenig wie für das einzige falsch-negative PCR-Resultat bei dem stx₁-, stx₂-, eae-, hlyA- und O157-positiven EHEC-Isolat (Probe # 1415344). Eventuell decken die eingesetzten Testkonzepte der entsprechenden Teilnehmer nicht das gesamte zu erwartende Spektrum an „üblichen“ stx₁- und stx₂-Genen ab (Gennachweis gilt als molekularer Marker für das Vorliegen von EHEC/STEC bzw. Shigella dysenteriae Typ 1 bei stx₁).

Die Probe # 1415343 (E. coli K12 Stamm, eae-, hlyA-negativ) wurde von nahezu allen Teilnehmern korrekterweise als negativ befundet – sie führte lediglich bei einem der insgesamt 133 Teilnehmer zu einem falsch-positiven Ergebnis. Die Probe # 1415341, welche Salmonelle enterica ser. Typhi (~1x10⁵ CFU/mL) enthielt, wurde erfreulicherweise von allen Teilnehmern korrekt als negativ für EHEC/STEC berichtet.

Neben in-house Testsystemen werden zunehmend vorkonfektionierte kommerzielle Assays eingesetzt. In den Richtigkeitsquoten zeigte sich keine Über- bzw. Unterlegenheit eines Systems, was für die breite Etablierung PCR-/NAT-gestützter Testsysteme spricht.

Zudem wurden von 112 Teilnehmern die Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin-Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin (eae)- und/oder Enterohämolysin (hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest in dem mitgeteilten Umfang, großteils korrekt. Lediglich zwei Teilnehmer berichteten hier unkorrekte Ergebnisse.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: RealStar EHEC PCR Kit von Altona diagnostic (2x), AmpliGnost Verotoxin ½ (Diferenzierung) PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), r-biopharm RIDA GENE EHEC/EPEC (1x), TIB Molbiol LightMix stx₁, stx₂, eae (1x), fast-track Diagnostics (1x) und LightMix Kit von TIB Molbiol (1x).

Nachdem die Probenauswahl des letzten Ringversuchs mehr auf die analytische Spezifität der eingesetzten Testsysteme abzielte, wollten wir uns im aktuellen Ringversuch wieder einmal auf die Prüfung der analytischen Sensitivität fokussieren. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt somit eine Probe mit einer hohen Menge an Borrelia garinii OspA Typ6 (# 1415353, ~1x10⁶ Organismen/mL), eine Probe mit etwas geringerer Menge (# 1415354, ~1x10⁵ Organismen/mL), eine Probe mit relativ geringer Menge (# 1415351, ~1x10⁴ Organismen/mL) sowie eine Probe ohne Zielorganismen, die eine relativ hohe Menge Treponema phagedenis enthielt (# 1415352, ~1x10⁵ Organismen/mL).

Nochmals eine kurze Rekapitulation: Mittlerweile sind 21 verschiedene dem B. burgdorferi sensu lato-Komplex zugehörige, genetisch eindeutig unterscheidbare Spezies beschrieben. Unterschiede in den zur Diagnostik herangezogenen Zielgenen können ein Problem für den PCR-/NAT-gestützten Nachweis darstellen. Gesichert humanpathogen und weit in Europa verbreitet sind B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii sowie die als neue Spezies akzeptierte B. bavariensis. Ebenfalls gesichert humanpathogen ist B. spielmanii, allerdings wurde diese Spezies bislang nur selten bei Erkrankungen (insbesondere Haut) oder in Zecken nachgewiesen. Als möglicherweise humanpathogen werden B. bissettii, B. lusitaniae und B. valaisiana eingestuft, alle in Europa nachgewiesen. Zu betonen ist auch die erhebliche genetische Heterogenität von B. garinii, die allein für das OspA zumindest fünf serologisch und genetisch differenzierbare Typen in Europa zeigt.

Nach dieser knappen Auffrischung zu den Ringversuchsergebnissen: Die Detektion von Borrelia garinii in den Proben mit relativ hoher Erregerlast (# 1415353 mit ~1x10⁶ Organismen/mL bzw. # 1415354 mit ~1x10⁵ Organismen/mL) bereitete keinem der Teilnehmer Probleme, sodass für beide Proben eine Quote richtig-positiver Ergebnisse von 100% erreicht wurde. Bei abnehmender Erregerlast (~1x10⁴ Organismen/mL) wurde von sechs Teilnehmern ein falsch-negatives Ergebnis berichtet. Drei Teilnehmer beobachteten mit ihren Borrelien-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen ein positives Ergebnis bei der negativen Probe # 1415352.

Da diese Probe die verwandte Spirochäte Treponema phagedenis enthielt, ist eine Kreuzreaktion aufgrund mangelnder Spezifität des entsprechenden Testsystems bei dieser Konstellation sehr wahrscheinlich. Laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung sind natürlich ebenfalls möglich und sollten ggf. kontrolliert und korrigiert werden. Interne oder externe Inhibitionskontrollen wurden von 126 der 128 Teilnehmer mitgeführt, signifikante Inhibitionsereignisse der PCR-Reaktion wurden im Rahmen dieser Ringversuchsrunde von keinem Teilnehmer beobachtet.

Im Großen und Ganzen waren im Rahmen dieses Ringversuchs auch keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen (Sensitivität zwischen 99 und 100%) und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen (durchschnittliche Sensitivität ca. 97%) zu beobachten. Dennoch kann angemerkt werden, dass von den sechs Teilnehmern, die ein falsch-negatives Ergebnis für die Probe # 1415351 mit relativ geringer Erregerlast berichteten, fünf davon durch in-house Testsysteme generiert wurden. Gegebenenfalls sollte also die Sensitivität der hauseigenen Testsysteme überprüft werden.

Darüber hinaus wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: GeneProof Borrelia burgdorferi PCR Kit (8x), EliGene Borrelia LC von Elisabeth Pharmacon (3x), EliGene Borrelia RT von Elisabeth Pharmacon (1x), Autoimmun Diagnostika GenID Zecken Screening Kit (2x), RealLine Borrelia burgdorferi Kit von Bioron (1x), Immundiagnostik MutaGEL Borrelia PCR (1x), BactoReal B. burgdorferi von Ingenetix (2x), Attomol Borrelia burgdorferi Realtime (3x) und ixSave Borrelia real time PCR Kit TM von Gerbion (1x).

Wie schon beim letzten Mal hier vorab nochmals der Hinweis: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Er ist daher NICHT für die Abprüfung von immunologischen Direktnachweisverfahren wie L. pneumophila SG1 Urin-Antigen Testen o.ä. geeignet. Einzelne Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets können daher typischerweise auch relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von L. pneumophila-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine sehr stark positive Probe # 1415362, die mit einer Menge von ca. 10⁶ CFU/mL an Legionella pneumophila-Serogruppe 5 versetzt war sowie eine Probe mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1415363, ca. 10⁵ CFU/mL) an Legionella pneumophila-Serogruppe 5. Die Probe # 1415364 des aktuellen Sets enthielt ca. 105 CFU/mL an Legionella dumoffii. Die zweite „negative“ Probe # 1415361 des aktuellen Probensets enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich E. coli.

Diese wurde erfreulicherweise von 105 der insgesamt 108 Teilnehmer als negativ für Legionella pneumophila-DNA befundet. Zwei Teilnehmer berichteten ein falsch-positives Ergebnis und ein weiterer Teilnehmer ein fragliches Ergebnis. Da diese Probe lediglich E. coli-Zellen enthielt, ist eine Kreuzreaktion aufgrund mangelnder Spezifität des entsprechenden Testsystems bei dieser Konstellation sehr unwahrscheinlich. Vermutlich ist das falsch-positive Ergebnis hier durch laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung bedingt.

Die relativ stark positive Probe # 1415362 mit ca. 10⁶ CFU/mL an Legionella pneumophila SG5 wurde mit einer Ausnahme von allen 108 Teilnehmern korrekterweise als positiv interpretiert. Die etwa 10-fach geringere Menge an Legionella pneumophila-Zielorganismen in Probe # 1415363 (ca. 10⁵ CFU/mL) konnte ebenfalls von fast allen Teilnehmern korrekt als positiv identifiziert werden. Lediglich zwei Teilnehmer reichten falsch-negative Ergebnissse ein. Insgesamt sprechen die Ergebnisse für die gute Sensitiviät der verwendeten Testsysteme, die allenfalls vereinzelt berichteten falsch-negativen Ergebnisse beruhen vermutlich eher auf anwendungstechnischen Problemen als auf unzureichender analytischer Sensitivität. Die mit Legionella dumoffii (~1x10⁵ CFU/mL) versetzte Probe wurde von 99 Teilnehmern mit L. pneumophila-spezifischen PCR-/NAT-Testsystemen korrekt als negativ befundet. 9 Teilnehmer berichteten ein falsch-positives Ergebnis, was auf eine Kreuzreaktion bzw. mangelnde Speziesspezifität der Zielsequenz zurückzuführen sein dürfte. Vor allem in-house real-time PCR Protokolle mit ribosomalen Zielsequenzen zeigten in der Vergangenheit immer wieder Probleme bei der Speziesspezifität. Bei Verwendung von nested Block-Cycler PCR-Protokollen zur Amplifikation von spezifischen Bereichen der 16S rDNA und anschließender DNA-Sequenzierung sollte jedoch der Fehler eher auf Anwenderseite gesucht werden (beispielsweise Kontaminationsereignisse bei der Probenaufbereitung und -abarbeitung), da dieses Testkonzept in jedem Fall die Unterscheidung der Spezies erlauben sollte.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 57 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila-DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Signifikante Unterschiede bezüglich der analytischen Sensitivität zwischen kommerziellen und selbstentwickelten Testsystemen (von 50 Teilnehmern verwendet) fanden sich nicht. Inhibitionskontrollen wurden offenbar von 107 der 108 Teilnehmer durchgeführt, wobei ein Teilnehmer ein signifikantes Inhibitionsereignis in der mit E. coli versetzten „negativen“ Probe berichtete.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt eine Probe mit relativ hoher Menge an Salmonella enterica ser. Enteritidis (# 1415374; ~1x10⁵ CFU/mL), eine Probe mit dem gleichen Isolat in einer etwa zehnfach geringeren Menge (# 1415371; ~1x10⁴ CFU/mL) sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1415372 und # 1415373), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte diesmal bei allen 4 Proben des Ringversuchssets zu tadellosen Richtigkeitsquoten von 100%. Auch die schwächer positive Probe # 1415371 wurde von allen Teilnehmern korrekt als positiv befundet. In vorausgegangenen Ringversuchen waren bei dieser niedrigeren Erregerlast immer wieder falsch-negative Ergebnisse berichtet worden. Das aktuelle Ergebnis unterstützt somit auch die analytische Sensitivität der eingesetzten Testsysteme.

Da in der aktuellen Ringversuchsrunde keine falsch-positiven Befunde mitgeteilt wurden, deutet dies, im Vergleich zu manchen der vorhergehenden Ringversuchsrunden, auch auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin, denn unmittelbar nach der positiven Probe # 1415371 (ca. 10⁴ CFU/mL) folgte diesmal eine negative Probe, die von keinem der 19 Teilnehmer positiv getestet wurde. Das erreichte Niveau konstant zu halten muss jetzt das Ziel sein!

Jeweils ca. die Hälfte der Teilnehmer verwendete kommerzielle bzw. selbstentwickelte Testsysteme. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ von einem Teilnehmer die Verwendung des folgenden Kits aufgeführt: r-biopharm RIDA GENE Bacterial Stool Panel (2x), Fast Track Diagnostics Kit (1x) und Diarella Salmonella real time PCR Kit von Gerbion (1x).

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken. Daher werden gelegentlich auch andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe dieses Ringversuchs zu finden sein. So wie im Fall der Probe # 1415383, die diesmal relativ hohe Mengen an L. innocua enthielt. Probe # 1415384 enthielt eine relativ hohe Menge an L. monocytogenes (ca. 10⁵ CFU/mL), die von allen der insgesamt 36 Teilnehmer korrekt erfasst wurde. Probe # 1415381 enthielt mit ca. 10⁴ CFU/mL eine etwa zehnfach geringere Menge an Zielorganismen, die ebenfalls von allen Teilnehmern mit ihren jeweiligen spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert werden konnte.

Wie bereits in vorangegangenen Ringversuchsrunden wurden von den Teilnehmern ganz überwiegend Listeria monocytogenes-spezifische Testsysteme eingesetzt. Dies spiegelte sich in der Probe # 1415383 wider, welche eine relativ hohe Menge an L. innocua (1x10⁵ CFU/mL) enthielt. Lediglich ein Teilnehmer berichtete diese Probe korrekt als positiv. Im Umkehrschluss spricht diese Datenlage jedoch für eine erfreulich hohe Spezifität der eingesetzten L. monocytogenes-spezifischen Testsysteme. Bei diesem Ringversuch besteht nämlich explizit die Option einer differenzierten Befundmitteilung: hält ein Teilnehmer lediglich ein L. monocytogenes-spezifisches NAT-Verfahren vor, so kann er dies über den Zusatzcode [71] im Ergebnisfeld angeben, und für die Erstellung des individuellen Zertifikats seitens INSTAND e.V. werden dann auch nur die L. monocytogenes-spezifischen Ergebnisse zur Bewertung herangezogen.

Die Tatsache, dass die „negative“ Probe # 1415382 von allen Teilnehmern korrekt als negativ berichtet wurde, spricht für eine sehr gute Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden Laboratorien.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt:

AmpliGnost L. monocytogenes von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), Seegene Meningitis B MultiNA (1x), L. monocytogenes von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), Sacace L. monocytogenes Kit (1x), Fast Track Diagnostics Neonatal meningitis (1x) und Diarella Listeria real time PCR Kit TM von Gerbion (1x).

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasen- oder Wundabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostischen Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Nach den zugegebenermaßen etwas umfangreichen und ausführlichen Diskussionen der Ergebniskonstellationen vorhergegangener MRSA-Ringversuche kann die Auswertung des aktuellen Ringversuchs wieder einmal erfreulich kurz gehalten werden. Da wir diesmal, abgesehen von einem „interessanten“ mecC-positiven MRSA-Isolat und einer Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (eine Konstellation die in der täglichen Praxis nicht gerade selten beobachtet wird), keine besonders „schwierigen“ oder komplexen Probenkonstellationen versandt haben, wurden von den insgesamt 298 Teilnehmern mit ihren unterschiedlichsten NAT-gestützten Testsystemen nahezu durchweg korrekte PCR-Ergebnisse für 3 der insgesamt 4 Proben des aktuellen Panels berichtet.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) der statistischen Auswertung dargestellt, enthielt die Probe # 1415392 diesmal ein Gemisch aus einem S. aureus-Isolat (MSSA, PVL-negativ, ~10³ CFU/mL) und einer Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies (S. epidermidis; mecA-positiv, ~10³ CFU/mL), die Probe # 1415394 ein typisches MRSA-Patientenisolat (MRSA; PVL-negativ, ~1x10⁴ CFU/mL) und Probe # 1415391 eine relativ hohe Menge eines mecC-positiven Methicillin-resistenten S. aureus-Patientenisolats (MRSA; PVL-negativ; spa: spa:t10009; ~1x10⁵ CFU/mL). Die letzte der 4 Proben, # 1415393, enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich eine nennenswerte Menge an E. coli.

Erfreulicherweise wurden im aktuellen Ringversuch bei der positiven MRSA-Probe # 1415394 von nahezu allen der 298 Teilnehmer durchweg korrekt positive PCR/NAT-Ergebnisse mitgeteilt. Der technische oder methodische Hintergrund der 2 falsch-negativen und der 2 als „fraglich“ klassifizierten Ergebnisse bei dieser Probe ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen. Möglicherweise wurden von zwei dieser 4 Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) PCR-Testsysteme mit unzureichender analytischer Sensitivität eingesetzt oder es ging während der Probenaufarbeitung ein gewisser Anteil der Template-DNA bei der DNA-Isolierung oder der Komplettierung der PCR-Ansätze verloren. Angesichts der mit 1x10⁴ CFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1415394 den betroffenen Ringversuchsteilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Im Vergleich zu früheren Ringversuchen mit vergleichbarer Probenkonstellation wurde bei Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies in Probe # 1415392 diesmal eine erfreulicherweise hohe Richtigkeitsquote erzielt. Von 278 der insgesamt 298 Teilnehmer wurde dieses Gemisch mit den jeweils eingesetzten Testsystemen korrekt als „MRSA-negativ“ befundet, weitere 9 Teilnehmer haben ihr Ergebnis bei dieser Probe als „fraglich“ klassifiziert. Von 5 dieser 9 Teilnehmer mit fraglichem Befund wurde explizit die Verwendung eines PCR-Testsystems angegeben, das auf einer getrennten Erfassung von S. aureus-spezifischen Markern und dem mecA Gen beruht. Da mit dieser Art von Testsystemen zwar die Anwesenheit des mecA-Gens nachgewiesen werden kann, dessen Herkunft aber nicht zweifelsfrei dem Genom der ebenfalls nachgewiesenen S. aureus und/oder der Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies zugeordnet werden kann, ist in diesem Fall „fraglich“ auch das wissenschaftlich korrekte Untersuchungsergebnis.

Die restlichen Teilnehmer berichteten bei dieser Mischung aus einem MSSA-Isolat und einer Methicillin-resistenten Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies falsch-positive Ergebnisse für MRSA. Diesen 11 Teilnehmern mit falsch-positivem Ergebnis für Probe # 1415392 ist dringend anzuraten, ihre Testsysteme zu überprüfen bzw. die methodische Eignung ihres jeweiligen Testkonzepts zu hinterfragen. In der mikrobiologischen Praxis wird relativ häufig die gleichzeitige Anwesenheit einer Methicillin-resistenten (also mecA-positiven) Koagulase-negativen Staphylokokkenspezies und eines Methicillin-empfindlichen (also mecA-negativen) S. aureus-Isolates in dem entsprechenden Abstrichmaterial beobachtet. In diesem Fall würden die Testsysteme der letztgenannten 11 Teilnehmer vermutlich fälschlicherweise einen Hinweis auf das Vorliegen einer MRSA-Infektion bzw. -Besiedelung anzeigen (mit allen hinlänglich bekannten Konsequenzen für den betroffenen Patienten!). Wenn man sich die entsprechenden Richtigkeitsquoten für Probe # 1415392 in Tab. 3 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) nach Testkonzepten differenziert betrachtet, dann wird schnell ersichtlich, dass alle der derzeit etablierten SCCmec-basierten Testsysteme bei diesem Gemisch korrekterweise MRSA-negative Befunde liefern (da das S. aureus-Genom der MSSA-Komponente ja de facto keine integrierte SCCmec Kassette aufweist).

Die augenscheinlich „schlechte Datenlage“ bei der MRSA-positiven Probe # 1415391 ist bei näherer Betrachtung schnell erklärt. Hierbei handelt es sich um ein S. aureus-Patientenisolat, dessen phänotypische Oxacillin-Resistenz nicht über die Anwesenheit des „üblichen“ mecA-Gens sondern vielmehr über das mecC-Gen kodiert bzw. vermittelt wird.

Hierbei handelt es sich um mittlerweile zwar mehrfach aber jedoch noch sehr sporadisch beobachtete Oxacillin-resistente S. aureus-Isolate, die auf Gesamtgenomebene alle üblicherweise verwendeten S. aureus-Speziesmarker aufweisen, sich in der SCCmec-orfX Region aber auf Sequenzebene von den „typischen“ MRSA-Isolaten deutlich unterscheiden und zusätzlich noch anstatt des „populären“ mecA-Gens ein resistenzvermittelndes mecC-Gen mit stark abweichender Gensequenz tragen. Bei den mit diesem mecA-Homolog ausgestatteten Bakterienisolaten erfolgt die Integration des mecC-Gens innerhalb einer neuartigen SCCmec Genkassette vom Typ XI in das S. aureus-Genom (selbst auf Aminosäureebene weisen das mecA- und mecC-Genprodukt eine Homologie von weniger als 63% auf). Diese signifikanten Sequenzunterschiede führen bei allen kommerziellen oder in-house SCCmec basierten PCR-Testsystemen, die nicht auf die speziellen Gensequenzen des mecC-Gens hin optimiert wurden, zwangsläufig zur „Nichterkennung“ solcher mecC-positiven MRSA-Isolate. Das MRSA-Isolat im Probe # 1415391 konnte daher (erwartungsgemäß) nur von einigen Teilnehmern mit speziell auf dieses „neue“ Methicillin-Resistenzgen abgestimmten Testsystemen detektiert werden. Auch wenn solche mecC-positiven MRSA-Isolate derzeit zumindest in unseren Breiten noch sehr selten nachgewiesen werden, so soll mit der Mitführung dieses Isolats bei den Teilnehmern und innerhalb der Leserschaft dieser Ringversuchsdiskussion zumindest das Bewusstsein für das mögliche Vorkommen solcher mecC-positiven MRSA-Isolate geweckt werden. Derzeit beschränkt sich der Nachweis von mecC-positiven MRSA-Isolaten (methoden- oder prävalenzbedingt?) noch auf einige wenige Einzelfälle. Inwieweit jedoch die Entwicklung und das zusätzliche Mitführen von mecC-spezifischen PCR/NAT-Testsystemen erforderlich sein wird, kann sich erst im Rahmen zukünftiger systematischer Prävalenzstudien zeigen.

Um die Ergebnislage in Tab. 3 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 12) nicht allzusehr durch die mecC-Problematik zu verzerren, haben wir diesmal eine zusätzliche Tab. 4 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 13) angefertigt. Hier sind explizit die Richtigkeitsquoten der einzelnen Testsysteme ohne Berücksichtigung der Probe # 1415391 aufgeführt.

Bei der Probe ohne Zielorganismen (# 1415393), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt, wurden im Rahmen des aktuellen Ringversuchs nur von zwei der 298 Teilnehmer ein falsch-positives MRSA-Ergebnis beobachtet. Dabei liegt das Auftreten eines sporadischen laborinternen Kontaminationsereignisses oder einer Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe.

Solche „Ausreißer“ sind bei technisch aufwändigen Ringversuchen mit nahezu 300 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen meines Erachtens keiner weiteren Diskussion.

Insgesamt bleibt festzuhalten, dass der erfreulich große Anteil von richtig-positiven Ergebnissen, bei der einen positiven Probe und die überwiegend richtig-negativen Befunde bei den 2 MRSA-negativen Proben, erneut für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminations- und Verschleppungsereignissen spricht.

Abgesehen von der besagten Probe mit dem mecC-positiven MRSA-Isolat spricht die Ergebnislage dieses Ringversuchs erneut für eine hohe Zuverlässigkeit des NAT-gestützten Direktnachweises von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial. Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit den Proben dieses Ringversuchs wieder standardisierte Rückstellproben zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine-Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende (PVL-negative) Ergebnisse der molekularbiologischen PVL-Testung wurden von 65 der insgesamt 298 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt und mit Ausnahme eines Teilnehmers waren diese diesmal durchweg korrekt. Nähere Informationen zu der, nach wie vor hochaktuellen, cMRSA bzw. CA-MRSA-Problematik finden sich beispielsweise unter [2] oder [3]. Ein gut evaluiertes real-time PCR-Protokoll für den gezielten Nachweis von PVL-positiven S. aureus-Isolaten findet sich beispielsweise in [4]. Mittlerweile sind auch schon einige kommerzielle real-time PCR-Testsysteme für den zuverlässigen molekulargenetischen Nachweis von PVL-Genen bei MRSA- und MSSA-Isolaten verfügbar (z.B. von r-biopharm oder von TIB Molbiol).

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: r-biopharm RIDAGENE MRSA PCR (21x), HAIN Lifescience FluoroType MRSA (8x), HAIN Lifescience Genotype Staphylococcus (6x), HAIN Lifescience Genotype MRSA (1x), Alere detect ready MRSA Panel Plus (2x), Sentosa SA MRSA PCR test von VELA diagnostics (2x), TIB Molbiol LightMix MRSA (1x), Roche Cobas 4800 System (1x), Amplex hyplex MRSA (1x) und Diarella MRSA real time PCR Kit TM von Gerbion (1x).

Eine wichtige Anmerkung wie immer vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae-DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben in einer Art Verdünnungsreihe. Eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1415401; C. pneumoniae, ~5x10⁵ IFU/mL), eine mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1415403; C. pneumoniae, ~5x10⁴ IFU/mL), eine Probe mit sehr geringer Menge (# 1415402; C. pneumoniae, ~1x10³ IFU/mL) sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1415404; nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen).

Analog zu vorhergegangenen Ringversuchen wird bei der Auswertung der Ergebnisse auch diesmal die hervorragende analytische Sensitivität und Spezifität der gegenwärtig eingesetzten und z. T. auch bereits sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesysteme für den Nachweis von C. pneumoniae-DNA eindrucksvoll aufgezeigt. Aus den in der Tab. 2 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) aufgeführten Daten ist zu entnehmen, dass im aktuellen Ringversuch alle Teilnehmer die Zielorganismen in der positiven Probe # 1415401 (ca. 10⁵ IFU/mL) sicher und zuverlässig nachweisen konnten. Auch die zehnfach geringere Menge an Zielorgansimen der Probe # 1415403 konnte von 128 der 129 Teilnehmer korrekt als positiv befundet werden. Die sehr geringe Erregermenge in Probe # 1415402 (10³ IFU/mL) wurde erfreulicherweise auch von fast allen teilnehmenden Laboratorien erfasst und korrekt bewertet. Für diese Probe fanden sich nur vier falsch-negative Ergebnisse, dennoch sollte von diesen Teilnehmern die Sensitivität des eingesetzten Testsystems sowie die Arbeitsabläufe evaluiert werden, auch wenn es sich zugegebenermaßen um eine geringe Erregerlast handelt.

Für die Probe ohne Zielorganismen # 1415404 (Escherichia coli) dokumentierten 126 der 129 Teilnehmer ein korrektes negatives Ergebnis. Daneben fanden sich für diese Probe noch zwei falsch-positive und ein fragliches Ergebnis. Dies unterstreicht einerseits aufs Neue die hohe analytische Spezifität der eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zum Nachweis von C. pneumoniae-DNA. Andererseits könnte es sich bei den beiden isoliert falsch-positiven Ergebnissen eventuell um sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Kreuzreaktivitäten der C. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit DNA E. coli erscheinen eher als unwahrscheinlich.

Eine signifikante Inhibition der PCR-Reaktion in einer der versandten Proben (# 1415404) wurde von einem der Teilnehmer beobachtet, Inhibitionskontrollen wurden von insgesamt 128 der 129 Teilnehmer durchgeführt.

Selbstentwickelte in-house NAT-Testsysteme zur Detektion von C. pneumoniae DNA wurden von 56 Labors eingesetzt, kommerzielle Assays wurden von 79 Teilnehmern verwendet.

Aufgrund des leider noch relativ geringen Anteils und der nicht durchgehenden Spezifizierung von kommerziellen Testsystemen innerhalb des Teilnehmerfeldes lassen sich derzeit keine seriösen Vergleiche zwischen bestimmten kommerziellen Kits und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit führen.

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 14 Teilnehmern die Verwendung des TIB Molbiol LightMix C. pneumoniae Testsystems, von 7 Teilnehmern der Diagenode MP/CP Kit und von 2 Teilnehmern der kommerzielle AmpliGnost CP PCR Kit angegeben. Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bac Kit (9x), GeneProof C. pneumoniae PCR Kit (9x), AmpliGnost Easy Mag C. pneumoniae PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (5x), Biomerieux Argene Chla/Myco pneumo r-gene (3x), Ingenetix Bacto Real Chlamydophila pneumoniae (2x), Seegene Seeplex PneumoBacter ACE detection (2x), Seegene PneumoBacter MultiNA (1x), Fast Track Diagnostics FTD Atypical CAP Kit (2x), Fast Track Diagnostics FTD Respiratory pathogens 33 (1x), Mikrogen Diagenode Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae Real Time PCR (1x), Immundiagnostik MutaPLATE C. pneumoniae (1x), RespiFinder SMART 22 FAST (1x), Vircell Speed-oligo Chlamydophila pneumoniae (1x) und Euroclone Duplica Real Time C. pneumoniae (1x).

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern der vergangenen Ringversuche hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut, wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial, konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Dieses Mal waren jedoch keine Proben mit geringen Mengen an Zielorganismen im ausgesandten Probenset vertreten.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 15) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal zwei positive Proben: Probe # 1415412 mit einer hohen Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁶ Genomkopien/mL) und Probe # 1415414 mit einer etwa zehnfach geringeren Menge an Zielorganismen (M. pneumoniae, ~1x10⁵ Genomkopien/mL). Um im Rahmen der Möglichkeiten dieses Ringversuchskonzepts auch die Spezifität der eingesetzten Testsysteme abzuprüfen, enthielt Probe # 1415413 (Mycoplasma genitalium; ~1x10⁵ Genomkopien/mL) diesmal nennenswerte Mengen an einer zu dem Zielorganismus verwandter Mykoplasmen-Spezies. Probe # 1415411 enthielt ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Ausnahmslos konnten die 135 Teilnehmer die DNA der M. pneumoniae-Zielorganismen in der relativ stark positiven Probe # 1415412 problemlos und zuverlässig nachweisen. Der Nachweis von M. pneumoniae-DNA in der etwas schwächer positiven Probe # 1415414 gelang 133 von 135 Teilnehmern.

Zum Vergleich sei hier kurz auf den vorhergehenden Ringversuch November 2013 verwiesen: hier konnten 103 von 104 Teilnehmern die M. pneumoniae-DNA in einer vergleichbar konzentrierten positiven Probe mit ca. 105 Genomkopien/mL nachweisen. Für die mit E. coli versetzte „negative“ Probe # 1415411 wurde erfreulicherweise nur ein falsch-positives Ergebnis berichtet. Zugrundeliegen dürften diesem am ehesten sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bei der Probenextraktion und -abarbeitung. Für die zweite „negative“ Probe, welche mit ~10⁵ Genomkopien/mL Mycoplasma genitalium – einer dem Zielorganismus verwandten Bakterienspezies – versetzt war, wurden von 9 Teilnehmern falsch-positive Ergebnisse berichtet, 125 Labors befundeten diese Probe korrekt als negativ. Bei den falsch-positiven Ergebnissen könnte es sich eventuell um sporadische laborinterne Kontaminationsereignisse bzw. eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung handeln. Eventuelle Kreuzreaktivitäten der M. pneumoniae-spezifischen PCR-Testsysteme mit DNA von anderen Mykoplasmen-Spezies sollten von den betroffenen Teilnehmern abgeprüft und die entsprechenden Testkonzepte ggf. nachgebessert werden. Insgesamt jedoch zeigte die Ergebniskonstellation in einem breiten Teilnehmerfeld mit unterschiedlichsten Testsystemen und PCR-Protokollen eine relativ hohe analytische Spezifität der eingesetzten PCR/NAT-Testsysteme zum Nachweis von M. pneumoniae-DNA.

Selbstentwickelte PCR-/NAT-Testsysteme kamen bei 62 Teilnehmern zum Einsatz, während 72 Teilnehmer kommerzielle Testsysteme verwendeten. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bac Kit (9x), GeneProof M. pneumoniae PCR Detection Kit (9x), AmpliGnost M. pneumoniae PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (6x), Biomerieux Argene Chla/Myco pneumo r-gene (3x), Fast Track Diagnostics FTD Respiratory pathogens 21 (2x), Fast Track Diagnostics FTD Atypical CAP (2x), Ingenetix Bacto Real Mycoplasma pneumoniae (2x), Seegene Seeplex PneumoBacter ACE detection (1x), Vircell Speed-oligo Mycoplasma pneumoniae (1x), Immundiagnostik MutaREAL M. pneumoniae (1x), Seegene PneumoBacter MultiNA (1x), Euroclone Duplica Real Time M. pneumoniae (1x) und RespiFinder SMART 22 FAST (1x). Die Richtigkeitsquoten lagen bei in-house und vorkonfektionierten Assays auf vergleichbarem Niveau.

Auch hier wieder eine Anmerkung vorweg: Der kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetii & Bacillus anthracis ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Coxiella burnetii- und Bacillus anthracis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Coxiella burnetii (~1x10³ Genomkopien/mL in Probe # 1415424 und ~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1415423), zwei Proben mit 5-fach unterschiedlicher Menge an Bacillus anthracis-DNA (~1x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1415422 und ~5x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1415423) sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1415421), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Der Übersichtlichkeit halber haben wir uns bei diesem kombinierten Ringversuch entschlossen, die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen darzustellen: für Coxiella burnetii in den Tab. 2 und 3 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 16) sowie für Bacillus anthracis in den Tab. 4 und 5 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 17).

Coxiella burnetii: Wie bereits im vorausgegangenen Ringversuch gestaltet sich auch in der aktuellen Runde die Ergebnislage erfreulich einfach. Sowohl die etwas stärker positive Probe # 1415423 mit ca. 10⁴ Genomkopien C. burnetii/mL als auch die zweite positive Probe # 1415424 des Probesets mit einer etwa zehnfach geringeren Menge an C. burnetii (ca. 10³ Genomkopien/mL) wurde diesmal von allen der insgesamt 27 Teilnehmer mit ihren jeweiligen C. burnetii-spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert. Diese Ergebnislage deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus den vorherigen Ringversuchen. Bei der Probe ohne Zielorganismus # 1415421 (nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen) wurde von einem Teilnehmer ein falsch-positives Ergebnis berichtet, was am ehesten auf laborinterne Kontaminationsereignisse zurückzuführen sein dürfte. In Anbetracht der Tragweite eines falsch-positiven Nachweises eines L3-Erregers sollten alle Anstrengungen unternommen werden, Kontaminationen bei Aufbereitung und Abarbeitung der Proben zu verhindern. Die zweite „negative“ Probe # 11415422, welche ca. 1x10⁴ Genomkopien/mL Bacillus anthracis-DNA und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt, wurde von allen 27 Teilnehmern korrekt als negativ berichtet.

Mit 20 diagnostischen Labors, welche in-house Testsysteme zum spezifischen Nachweis von C. burnetii verwenden, waren die selbstentwickelten Assays den vorkonfektionierten kommerziellen Testkits zahlenmäßig überlegen. Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von C. burnetii-DNA von 26 der 27 Teilnehmer enthielten eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Bacillus anthracis: Die Ergebnislage des Ringversuchs „Bacillus anthracis-DNA“ ist ebenfalls relativ schnell dargestellt und kann bayerisch-prägnant mit „baßt scho“ zusammengefasst werden.

Alle der 16 Teilnehmer konnten mit ihren jeweils vor Ort etablierten Bacillus anthracis spezifischen PCR/NAT-gestützten Testsystemen die beiden positiven Proben mit ca. 1x10⁴ Genomkopien/mL (# 1415422) und mit ca. 5x10⁴ Genomkopien/mL (# 1415423) an Bacillus anthracis-DNA erfolgreich nachweisen.

Ebenfalls von allen der 16 Teilnehmer wurden korrekt negative Ergebnisse für die Proben ohne entsprechende Zielorganismen # 1415421 (nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen) sowie # 1415424 (nur Coxiella burnetii mit ca. 10⁴ Genomkopien/mL und eine Suspension aus humanen Zellen) beobachtet. Insgesamt eine sehr erfreuliche Gesamtsituation.

Zudem stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für C. burnetii-DNA und B. anthracis-DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Der ebenfalls seit kurzem neu ins Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Francisella tularensis-DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 18) dargestellt, enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben: Probe # 1415432 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (F. tularensis spp. holarctica, ~1x10⁵ CFU/mL), Probe # 1415431 mit ca. zehnfach geringerer Menge (F. tularensis spp. holarctica, ~1x10⁴ CFU/mL) und Probe # 1415433 mit ca. ~1x10³ CFU/mL an F. tularensis spp. holarctica. Im Ringversuchsprobenset befand sich zudem eine Probe ohne Zielorganismen (#1415434), die nur humane Zellen und E. coli enthielt.

Ähnlich wie bei vorausgehenden Ringversuchen haben auch hier alle der 16 Teilnehmer die relativ stark positive F. tularensis spp. holarctica-Probe # 1415432 sowie die etwa 10-fach geringer konzentrierte Probe # 1415431 mit ihren NAT-gestützten Testsystemen korrekt identifiziert. Ein negatives Ergebnis wurde für diese beiden Proben von keinem der teilnehmenden Laboratorien berichtet. Die Probe mit der geringsten Erregermenge (~1x10³ CFU/mL) konnte noch von 13 der 16 Teilnehmer korrekt als positiv befundet werden. Die drei falsch-negativen Bewertungen sollten Anlass geben, das verwendete Testsystem bzgl. Sensitivität zu evaluieren und ggfs. zu optimieren. Die F. tularensis-negative Probe # 1415434 wurde von allen Teilnehmern erfreulicherweise durchgehend als negativ befundet. Die gesamte Ergebnislage deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorherigen Ringversuchen und spricht erneut für ein gutes Funktionieren sowohl der bei den jeweiligen Teilnehmern etablierten Testsysteme, als auch der implementierten laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von F. tularensis-DNA aller Teilnehmer enthielten eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Dieser aktuell als Probe-Ringversuch durchgeführte Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Carbapenemase-Gene“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zur molekularen Resistenztestung bzw. dem Direktnachweis von charakteristischen Carbapenemase-Genen aus DNA-Präparationen von Reinkulturen an Enterobacteriaceae konzipiert. Zum orientierenden Herantasten an die technische Eignung und die „Praktikabilität“ der versandten Probenmaterialien werden wir uns in den ersten Runden dieses methodisch anspruchsvollen Ringversuchs zur molekularen Resistenztestung auf die Abprüfung eines kleinen Spektrums der derzeit häufigsten Carbapenemase Gene bei Enterobacteriaceae beschränken: KPC, VIM, OXA-48 ähnliche Gene, GES-Carbapenemase, n NDM, IMP und GIM.

Wie in Tab. 1 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 19) der Auswertung dargestellt, enthielt das aktuelle Set drei Proben mit Carbapenem-resistenten Enterobacteriaceae: Probe # 1415441 enthielt Escherichia coli Zielorganismen mit NDM-1 Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL), Probe # 1415442 enthielt Enterobacter cloacae Zielorganismen mit VIM-1 Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL) und Probe # 1415444 enthielt ein Klebsiella pneumoniae-Isolat mit KPC-3 Gen (ca. 1x10⁷ Genomkopien/mL). Die vierte Probe # 1415443 war als eine Art von Negativkontrolle ausgelegt – sie enthielt lediglich E. coli ohne Carbapenemase-Gene.

Betrachtet man die aktuelle Ergebnislage so waren unsere sogfältigen und systematischen Evaluierungsaktivitäten im Vorfeld dieses Proberingversuchs erfeulicherweise offenbar zielführend. Sowohl die Probe # 1415441 mit NDM-1 positiven E. coli sowie die Probe # 1415442 mit VIM-1 positiven E. cloacae-Zielorganismen wurden von allen der insgesamt 26 Teilnehmer korrekterweise als positiv befundet.

Bei der Probe # 1415444 mit einem Carbapenem-resistenten K. pneumoniae-Isolat konnten leider nur 23 der insgesamt 26 Teilnehmer das resistenzvermittelnde KPC-3 Gen eindeutig nachweisen. Bei einem falsch-negativen Ergebnis sollte unbedingt eine Fehlersuche erfolgen, da ein molekularbiologischer Test die bedeutende Carbapenemase KPC aus Koloniematerial sicher erkennen muss. Denkbar ist, dass nach DNA-Präparation aus den lyophilisierten Proben des Ringversuchs geringere DNA-Mengen erhalten werden als nach Einsatz von Koloniematerial. Bei der Probe ohne Zielorganismen (# 1415443), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt, wurden im Rahmen des aktuellen Ringversuchs keine falsch-positiven Ergebnisse beobachtet. Dies spricht unter anderem für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Direktnachweis von Carbapenemase-Genen aller Teilnehmer enthielten eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Selbstentwickelte in-house NAT-Testsysteme zur Detektion von Carbapenemase-Genen wurden von 13 der insgesamt 26 teilnehmenden Laboratorien eingesetzt. Die andere Hälfte gab im Ergebnisformular die Verwendung von kommerziellen Testkonzepten oder -kits an. Aufgrund der leider noch nicht durchgehenden Spezifizierung von kommerziellen Testsystemen innerhalb des Teilnehmerfeldes lassen sich derzeit keine seriösen Vergleiche zwischen bestimmten kommerziellen Kits und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit führen. Bezogen auf die individuell ermittelten Richtigkeitsquoten in Tab. 3 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 19) war die gesamte Ergebnislage bei diesem Proberingversuch jedoch sehr gut.

Dieser im Jahr 2013 neu in unser Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch RV 560 „Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in geeigneten klinischen Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Zum orientierenden Herantasten an die unteren Nachweisgrenzen der im Anwenderkreis etablierten PCR/NAT-gestützten Testsysteme enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben in einer Art von Verdünnungsreihe (Tab. 1, siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 20): eine Probe mit hoher Menge an Zielorganismen (# 1415602; Pneumocystis jirovecii, ~1x10⁵ Genomkopien/mL), eine mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1415604; Pneumocystis jirovecii, ~1x10⁴ Genomkopien/mL), eine mit etwa hundertfach geringerer Menge (# 1415601; Pneumocystis jirovecii, ~2x10³ Genomkopien/mL) sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1415603), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Erfreulicherweise hat sich auch in der aktuellen Ringversuchsrunde die überaus gute Ergebnislage des im Mai 2013 erstmals regulär durchgeführten Ringversuchs RV 560 bestätigt. Sowohl die am stärksten positive Probe # 1415602 mit ca. 1x10⁵ Genomkopien/mL sowie die etwas schwächer positive Probe # 1415604 mit ca. 1x10⁴ Genomkopien/mL wurde von nahezu allen der insgesamt 84 Teilnehmer als positiv befundet.

Lediglich zwei der 84 Teilnehmer erzielten bei der am stärksten positiven Probe (# 1415602) wie auch bei der etwas schwächer positiven Probe (# 1415604) ein falsch-negatives Ergebnis. Angesichts der mit mehr als 10⁴ Genomkopien/mL nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten diese falsch-negative Ergebnis den betroffenen Ringversuchsteilnehmern Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihrer entsprechenden NAT-gestützten Testsysteme geben.

Der zuverlässige Nachweis von Pneumocystis jirovecii-DNA in der relativ schwach positiven Probe (# 1415601) mit ca. ~2x10³ Genomkopien/mL gelang immerhin noch 75 aller 84 Teilnehmer. Die Ergebnisse der Probe wurden bei diesem RV nicht in die Bewertung für das Zertifikat mit einbezogen, da diese relativ geringe Menge an Zielorganismen zum ersten Mal eingesetzt wurde. Dies ist auch durch die beiden grau schraffierten Felder in Tab. 2 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 20) gekennzeichnet. Angesichts der mit 2x10³ Genomkopien/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen und angesichts der zuverlässigen Detektion durch die überwiegende Mehrheit unserer Ringversuchsteilnehmer sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1415601 den betroffenen 8 Teilnehmern dennoch Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben.

Bei der Probe ohne Zielorganismen (# 1415603), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt, wurde im Rahmen des aktuellen Ringversuchs lediglich von einem Teilnehmer ein falsch-positives Ergebnis beobachtet. In diesem Fall liegt das Auftreten eines sporadischen laborinternen Kontaminationsereignisses oder einer Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung nahe. Andererseits sprechen 83 richtig-negative Ergebnisse für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen im Teilnehmerkreis.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [26] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: r-biopharm RIDAGENE Pneumocystis jirovecii (6x) und AmpliGnost P. jirovecii PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (4x).

Nicht zuletzt aufgrund dieser erfreulichen Ergebnislage werden sich in den zukünftig ausgesandten 4-er Sets auch immer positive Proben befinden, die relativ geringe Genommengen des entsprechenden Zielorganismus enthalten.