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Neben der Aussendung von lyophilisierten Probenmateralien zur systematischen Abprüfung von NAT-gestützten Testsystemen für derzeit 15 unterschiedliche bakterielle und fungale Zielorganismen bzw. Pathogenitätsfaktoren gab es im Rahmen dieser Ringversuchsrunde auch wieder gewisse „highlights“: so wurde beispielsweise im aktuellen RV 535 Borrelia burgdorferi eine Verdünnungsreihe an Borrelia garinii OspA Typ 3 versandt und die Probe mit der geringsten Menge an Zielorganismen (10³ Borrelien/mL) wurde nur noch von ca. 2/3 aller Teilnehmer erfolgreich detektiert. Als weiteres „Highlight“ innerhalb der aktuellen Ringversuchsrunde wurde in einer der 4 Einzelproben des RV 539 ein sog. lifestock-associated (LA) MRSA Isolat (Oxacillin-resistenter Staphylococcus aureus, charakteristischerweise MLST Typ 398 und mit einem aus molekularbiologischer Sicht „unexotischen“ SCCmec Kassettentyp) ausgesandt, das aber von nahezu allen PCR-/NAT-Testsystemen der Ringversuchsteilnehmer problemlos als MRSA identifiziert werden konnte.

Angesichts der beiden Milzbrandfälle bei Heroinkonsumenten aus dem Raum Regensburg, die wir in unserem Institut, sozusagen „unmittelbar vor Ort“, sowohl kulturell isoliert, mittels real-time PCR identifiziert und in enger Zusammenarbeit mit dem Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (München) und dem RKI (Berlin) auch molekular feintypisieren konnten, wird der Ringversuch RV 542 (Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetti) zukünftig um den Zielorganismus Bacillus anthracis erweitert. Er ist bereits im Ringversuchsprogramm als kombinierter PCR/NAT-Ringversuch „RV 542 Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetti/B. anthracis“ gelistet. Aufgrund des großen Interesses an geeigneten PCR-Protokollen und der Verfügbarkeit von entsprechendem Positivkontrollmaterial haben wir uns entschlossen, diesen kombinierten Ringversuch RV 542 als speziellen Service für die im L3-Bereich tätigen Kolleginnen und Kollegen ohne Mehrkosten im Vergleich zu dem vormaligen C. burnetti Ringversuch anzubieten. Bei der fachlichen Betreuung werden wir hier dankenswerterweise durch Herrn Kollegen PD Dr. Gregor Grass vom Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (München) unterstützt.

Der RV 560 zum PCR/NAT-gestützten Nachweis von Pneumocystis jirovecii DNA wird ebenfalls ab sofort in das reguläre Ringversuchsprogramm „Bakteriengenom-Nachweis PCR/NAT“ von INSTAND e.V. aufgenommen. An der Ringversuchsleitung wird meine Kollegin Frau Dr. Ingrid Reiter-Owona vom Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Parasitologie (IMMIP) in Bonn maßgeblich beteiligt sein.

Alle Teilnehmer sind natürlich weiterhin dazu aufgerufen, attraktive Parameter für eine zukünftige Erweiterung des Spektrums an Zielorganismen vorzuschlagen und deren mögliche Umsetzung mit dem Ringversuchsleiter zu diskutieren.

Entsprechend des Grundgedankens unserer Ringversuchsaktivitäten wurde auch bei der Konzeption des aktuellen Ringversuchs zum „Bakteriengenomnachweis mittels PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT)“ bei einigen Zielorganismen der Versand von Proben mit relativ niedrigen Erregerzahlen angestrebt.

In den aktuellen Ringversuchssets befanden sich daher erneut einige Proben mit relativ geringer Menge folgender Zielorganismen: Chlamydia trachomatis (Probe # 1315303), sowie die positive Probe des RV 531 # 1315314), Neisseria gonorrhoeae (Probe # 1315301), Bordetella pertussis (Probe # 1315323), Borrelia burgdorferi (Probe # 1315354), MRSA/cMRSA (Probe # 1315393), Chlamydia pneumoniae (Probe # 1315404), Coxiella burnetii (Probe # 1315421), sowie Bacillus anthracis (Probe # 1315421). Im Rahmen der Testentwicklung bzw. Testoptimierung können diese Probensätze u.a. als Qualitätskontrollen oder als standardisierte Sensitivitätsmarker für die Austestung der unteren Nachweisgrenze von eigenentwickelten Nukleinsäure-gestützten Testsystemen dienen.

An dieser Stelle möchten wir auch darauf hinweisen, dass zahlreiche Rückstell-Probensätze der früheren Ringversuche noch verfügbar sind und bei Bedarf über den Ringversuchsleiter formlos nachbestellt werden können.

Mit Ausnahme der zuvor erwähnten „grenzwertig positiven“ Einzelproben wurden die Mengen der entsprechenden Zielorganismen in den Probensätzen der aktuellen Ringversuchsrunde wieder relativ deutlich über der Nachweisgrenze von „durchschnittlich sensitiven PCR/NAT-Testkonzepten“ eingestellt. Diese definieren wir wie folgt: als Richtwert für die Bewertung von Ringversuchsergebnissen gilt das 10- bis 50-fache der unteren Nachweisgrenze durchschnittlich sensitiver PCR-Protokolle unter Standardbedingungen (50 µl Block-Cycler Reaktionsansätze, 35 PCR-Zyklen, ggf. entsprechende real-time PCR Protokolle; gut evaluierte Primersequenzen).

Bei den meisten Probenmaterialien der aktuellen Ringversuchsrunde stellen falsch-negative Ergebnisse damit einen deutlichen Hinweis auf ernstzunehmende Mängel innerhalb der eingesetzten Verfahren zur Nukleinsäure-Extraktion, Amplifikation und Detektion dar.

Falsch-positive Ergebnisse sind dagegen in der Regel als Hinweis auf eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung und/oder auf mangelnde Spezifität der eingesetzten Testsysteme zu betrachten.

In bewährter Form werden im Folgenden die Ergebnisse der jeweiligen erregerspezifischen Ringversuche dargestellt. Tab. 1 zeigt dabei die Probenzusammensetzung und das erwartete Ergebnis (Sollwert) mit den entsprechenden Codenummern der Ergebnisbögen. Die von den einzelnen Teilnehmern mitgeteilten Ergebnisse werden in Tab. 2 nach der Häufigkeit der Mitteilung von positiven oder negativen Ergebnissen und in Tab. 3 nach der absoluten Anzahl der richtig positiven und richtig negativen Ergebnisse sowie deren prozentualem Anteil (Befundhäufigkeit) je Amplifikationssystem bzw. Testkonzept aufgeschlüsselt. Für die objektive Bewertung von kommerziellen Testsystemen sollten neben der rein statistischen Betrachtung der mitgeteilten Ringversuchsergebnisse auch die Anzahl und vor allem die methodische bzw. technische Qualifikation der individuellen Teilnehmer berücksichtigt werden. Da wir im Zuge unserer Ringversuche aber das gesamte Spektrum von spezialisierten Expertenlabors bis hin zum „Gelegenheitsanwender“ abdecken, müssen die arithmetisch ermittelten Richtigkeitsquoten bei der Bewertung einzelner Testsysteme immer mit einem gewissen Toleranzbereich betrachtet werden.

Auch im Rahmen des hier diskutierten Ringversuchs waren wieder einige Auffälligkeiten hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität von bestimmten Testkonzepten und der für den Nachweis verwendeten Zielsequenzen zu beobachten. Diese Aspekte sind bei der Auswertung des jeweiligen Ringversuchs aufgeführt und dort auch kurz diskutiert. Zusätzlich stehen für die früheren, für diesen und für alle folgenden Ringversuche eine Reihe zusätzlicher Informationen (wie die graphisch dokumentierten Ergebnisse unserer quantitativen real-time PCR Testsysteme oder die Ergebnisse einiger kommerzieller PCR Testsysteme) auch unter folgender Internetadresse: http://www.udo-reischl.de; Unterpunkt „Auswertung der Ringversuche“ und neuerdings auch über die Homepage von INSTAND e.V. (http://www.instand-ev.de) als pdf-Files zum freien Download bereit. An dieser Stelle möchte ich mich noch einmal ausdrücklich bei den geschätzten Kolleginnen und Kollegen für ihre zahlreichen und überaus konstruktiven Kommentare und Anregungen zu den Ausführungen in dieser Ringversuchsdiskussion bedanken.

Die Ergebnislage des aktuellen Ringversuchs deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus vorangegangenen Ringversuchen zum kombinierten NAT-gestützten C. trachomatis und Gonokokken-Nachweis. Trotz der relativ geringen Erregermenge in den vier unterschiedlich zusammengesetzten positiven Proben führte auch diesmal die Verfügbarkeit gut evaluierter und zum Teil automatisierter NAT-gestützter Analysesysteme für Chlamydia trachomatis zu hohen Richtigkeitsquoten sowohl für positive als auch für negative Befunde.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei Proben mit relativ geringen Menge an C. trachomatis (# 1315301, ~5x10³ IFU/mL und # 1315303, ~1x10³ IFU/mL), eine Probe (# 1315301) mit ca. 1x10³ CFU/mL an N. gonorrhoeae und zwei Proben mit relativ hoher Menge an N. gonorrhoeae Zielorganismen (# 1315302 und # 1315304, ~1x10⁴ CFU/mL).

Auch wenn die beiden positiven Proben # 1315301 und # 1315303 des aktuellen Ringversuchs diesmal nur mit einer relativ geringen Menge an C. trachomatis Zielorganismen versetzt worden waren, fanden sich unter den von insgesamt 170 Teilnehmern mitgeteilten NAT-Ergebnissen für C. trachomatis lediglich 7 falsch-negative Ergebnisse. Da von einem Großteil der Anwender mit den unterschiedlichsten Testsystemen durchwegs korrekte Ergebnisse berichtet wurden, handelt es sich bei den falschen Ergebnissen vermutlich um Ringversuchstypische „sporadische Ausreißer“.

Im Rahmen des NAT-gestützten Gonokokken-Nachweises wurden für die Probe 1315301 (C. trachomatis und N. gonorrhoeae; ca. 5x10³ IFU bzw. ca. 1x10³ CFU/mL) diesmal von 25 der insgesamt 170 Teilnehmer falsch-negative Ergebnisse für Gonokokken DNA mitgeteilt. In den anderen beiden GO-positiven Proben (# 1315302 und # 1315304) befand sich mit 1x10⁴ CFU/mL zwar nur eine geringfügig höhere Menge an N. gonorrhoeae Zielorganismen – hier konnten jedoch (interessanterweise) nur 4 der insgesamt 170 Teilnehmer keine Gonokokken DNA nachweisen und es wurden lediglich 8 falsch-negative Ergebnisse mitgeteilt. Für diesen Effekt, der in ähnlicher Konstellation ja bereits im vorhergehenden Ringversuch vom November 2012 beobachtet wurde, hat der Ringversuchsleiter keine naheliegende Erklärung. Denkbar wäre natürlich eine gewisse Konkurrenzsituation der im Reaktionsgemisch der proprietären Testkits vorhandenen Primer-Moleküle. Zumindest aus wissenschaftlicher Sicht ist bei Chlamydien und Gonokokken aber davon auszugehen, dass die spezifische Amplifikation von Genomsegmenten dieser beiden unterschiedlichen Zielorganismen über unterschiedliche Primersets verläuft und seitens der Hersteller dafür keine Konsensus-Primersequenzen eingesetzt werden.

Angesichts der mit 1x10³ CFU/mL ehrlicherweise nicht als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen in der Probe # 1315301 sollten falsch-negative Ergebnisse bei betroffenen Ringversuchsteilnehmern Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen Gonokokken-spezifischen NAT-gestützten Testsystems geben.

Da sich das hier beobachtete „Sensitivitätsproblem“ offensichtlich nicht auf bestimmte Testkonzepte eingrenzen lässt und sich sporadisch durch das ganze Portfolio der eingesetzten Testsysteme zieht, kann dem großen Rest des Teilnehmerfeldes erneut eine erfreulich gute analytische Sensitivität und Spezifität ihrer CT- und GO-spezifischen NAT Testsysteme sowie der angewandten Prozeduren zur Probenaufarbeitung und -prozessierung attestiert werden.

Angesichts der streng normierten und standardisierten Abarbeitungsprotokolle von kommerziellen Testsystemen bleibt es für den Ringversuchsleiter jedes Mal aufs Neue verwunderlich, dass ein nennenswerter Anteil der teilnehmenden Laboratorien mit den betroffenen Testsystemen erfolgreich die vorgegebenen Zielwerte erreicht. Ohne denjenigen Teilnehmern, die mit bestimmten kommerziellen Testsystemen die Zielwerte nicht erreichen zu nahe treten zu wollen, deutet dieser Umstand in diesen Fällen dann wohl eher auf individuelle Abweichungen vom Protokoll oder bestimmte Fehler bei der Probenabarbeitung als auf intrinsische Unzulänglichkeiten der in der Regel gut evaluierten Testsysteme hin.

Ich glaube es ist auch für den Leser dieser Ringversuchsdiskussion weitgehend nachvollziehbar dass wir als Organisatoren von Testkonzept- und Testplattform-übergreifenden Ringversuchen bei der Konfektionierung unserer Probenmaterialien leider nicht jede Besonderheit im Abarbeitungsprotokoll von kommerziellen Testsystemen berücksichtigen oder unterschiedliche Arten von Ringversuchsprobenmaterial für bestimmte Testsysteme bereitstellen können.

Auf diesen Umstand wurde bereits bei früheren Ringversuchen mehrfach im Zusammenhang mit den RNA-Zielsequenzen der AMPLIFIED CT Testkits oder der APTIMA COMBO 2 Testkits (Hersteller: Gen-Probe Inc.) hingewiesen. Werden von Teilnehmern bestimmte NAT-Testsysteme eingesetzt, die erregerspezifische RNA-Zielsequenzen nachweisen oder auf einem RNA-basierten Amplifikationsprozess (TMA; Transcription-Mediated Amplification, o.ä.) beruhen, so kann mit dem hier versandten Probenmaterial offiziell keine regelgerechte Abprüfung der entsprechenden Sensitivitäten unter Routinebedingungen gewährleistet werden. Aber selbst wenn das Herstellungsverfahren unserer Ringversuchsproben primär nicht auf die Stabilisierung von RNA-Molekülen hin optimiert und getestet wurde, so konnten dennoch sowohl bei der aktuellen wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchsrunden von vielen Teilnehmern mit RNA-gestützten Testssystemen hohe Richtigkeitsquoten erzielt werden. Aktuell wurden zumindest die C. trachomatis Zielorganismen von allen 9 Teilnehmern mit RNA-basierten Gen-Probe Testsystemen erfolgreich nachgewiesen. Selbst der erfolgreiche Nachweis von Gonokokken RNA Zielsequenzen in den Proben # 1315302 und # 1315304 mit ca. 10⁴ CFU/mL gelang allen 9 Teilnehmern. Dies deutet, zumindest indirekt, auf ausreichend hohen Mengen an erregerspezifischen RNA-Molekülen in dem konfektionierten und lyophilisierten Probenmaterial hin.

Auffällig war jedoch die Ergebnislage unter den GenProbe Usern bei der Probe # 1315301 (ca. 5x10³ IFU/mL an C. trachomatis und ca. 1x10³ CFU/mL an N. gonorrhoeae): hier konnte lediglich einer der insgesamt 9 Anwender des konfektionierten und standardisierten GenProbe CT/NT Testsystems die Gonokokken RNA erfolgreich nachweisen.

Entsprechende Inhibitionskontrollen wurden von allen 170 Teilnehmern durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal nicht mitgeteilt.

Bei den ermittelten Richtigkeitsquoten für Teilnehmer mit dem Roche COBAS Amplicor, COBAS TaqMan, dem Becton Dickinson ProbeTec, Abbott RealTime CT/NG, Artus CT, LightMix CT/NG oder anderen Testsystemen muss berücksichtigt werden, dass im Rahmen dieser Ringversuchsauswertung in Tab. 3 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 2) nicht zwischen dem spezifischen Nachweis von Chlamydien und Gonokokken differenziert wurde. Mit dem Großteil dieser kombinierten Testsysteme wurden insgesamt erfreulich hohe Richtigkeitsquoten sowohl für die positiven als auch für die negativen Ergebnisse beobachtet. Um eine detaillierter Bewertung der C. trachomatis- und GO-spezifischen NAT-Komponenten dieser kombinierten Testsysteme zu ermöglichen wurden diesmal zusätzlich Tab. 4 und 5 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 2 und 3) angefertigt. In Tab. 4 sind dabei nur die C. trachomatis (CT)-spezifischen Ergebnisse und in Tab. 5 nur die Neisseria gonorrhoeae (GO)-spezifischen Ergebnisse dargestellt und statistisch ausgewertet.

Anmerkung: Bevor durch einen kurzen Blick auf die prozentualen Richtigkeitsquoten in diesen Tabellen ein eventuell etwas zu voreiliger Rückschluss auf die diagnostische „Performance“ bestimmter kommerzieller Testsysteme gezogen wird, sollten erst die effektiven Teilnehmerzahlen berücksichtigt werden, die den dargestellten Richtigkeitsquoten arithmetisch zugrunde liegen.

Dies gilt im aktuellen Ringversuch vor allem für die 2 (!) Teilnehmer mit dem Cepheid Xpert CT/NG Testsystem. Von einem Teilnehmer wurde hier ein falsch-negatives Ergebnis mitgeteilt und die Richtigkeitsquote sinkt dadurch von 100 auf 88%.

Im handschriftlichen Kommentarfeld der Ergebnisformulare wurden unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Roche Cobas 4800 System (7x), HAIN Lifescience GenoQuick CT (3x), HAIN Lifescience FluoroType CT (1x), HAIN Lifescience FluoroType NG (1x), Mikrogen Diagenode N. gonorrhoeae Real Time PCR kit (5x), TIB Molbiol LightMix NG (4x), GeneProof C. trachomatis PCR Kit (3x), GeneProof N. gonorrhoeae PCR Kit (3x), BD ProbeTec (2x), Amplex Hyplex STD (2x), Urethritis basic von fast-track Diagnostics (2x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (2x), Mikrogen Diagenode C. trachomatis Real Time PCR kit (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID STD Kit (1x), N. gonorrhoeae Amplex Multiplex ELISA (1x), NucliSENS easyMag von Biomerieux (1x), Medac/Goffin CT/NG Assay (1x), AmpliSens N. gonorrhoeae/C. trachomatis MULTIPRIME-FRT PCR Kit (1x), Bioron RealLine C. trachomatis/ N. gonorrhoeae (1x), AmpliGnost C. trachomatis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x), Seegene Anyplex™ STI-7 Detection (1x) und Seegene Seeplex STI Master Panel1 (1x).

Unabhängig von der Art des verwendeten Testsystems soll in diesem Zusammenhang auch noch einmal darauf hingewiesen werden, dass in Gegenwart von relativ hohen Mengen an Zielorganismen (bzw. deren Nukleinsäure) die interne Kontrollreaktion aufgrund der „Konkurrenzsituation“ mit der Amplifikation der eigentlichen Zielsequenz durchaus negativ ausfallen kann, obwohl keine Inhibition der PCR-Reaktion im eigentlichen Sinne vorliegt.

Das aktuelle Ringversuchsset enthielt diesmal zwei Proben mit relativ niedriger Menge an Zielorganismen (# 1315314 und # 1315312, ~1x10³ IFU/mL und ~5x10³ IFU/mL an C. trachomatis), sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1315311 und # 1315313), die ausschließlich nicht infizierte Zellen und Escherichia coli enthielten.

Wie Tab. 2 der statistischen Auswertung zu entnehmen ist (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 4), wurden bei den beiden positiven Proben durchwegs korrekte Ergebnisse für Probe # 1315312 und lediglich von 2 der insgesamt 115 Teilnehmer falsch-negative Ergebnisse für Probe # 1315314 mitgeteilt. Auch bei den C. trachomatis negativen Proben # 1315311 und # 1315313 wurden diesmal (bis auf 3 isoliert falsch-positive und 3 als „fraglich“ klassifizierte Ergebnisse) erfreulicherweise nahezu durchwegs richtig negative Ergebnisse berichtet.

Dies markante Übereinstimmung der aktuellen Ergebniskonstellation mit den Beobachtungen und Richtigkeitsquoten vorhergegangener Ringversuche mit ähnlicher Menge an C. trachomatis Zielorganismen kann, zumindest indirekt, erneut als Beleg für eine hohe Zuverlässigkeit und Konstanz der eingesetzten Testsysteme und der Probenabarbeitung angesehen werden.

Auch wenn mit 1x10³ IFU/mL an Zielorganismen im Probenmaterial die untere Nachweisgrenze hochsensitiver und standardisierter PCR/NAT-gestützter Testsysteme erreicht zu sein scheint, sollten bei Ringversuchsteilnehmern mit hohem Anspruch an die individuelle Testsensitivität sowohl falsch-negative als auch falsch-positive Ergebnisse Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Angesichts der nach wie vor anhaltenden Diskussion um das „pooling“ von entsprechendem Untersuchungsmaterial bleibt der der Aspekt der analytischen Sensitivität der jeweils eingesetzten Testsysteme bedeutsam.

Inhibitionskontrollen wurden von 113 der 115 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal bei 2 der insgesamt 460 Einzel-Testergebnisse beobachtet. In diesem Zusammenhang sei kurz angemerkt, dass wir auch im aktuellen Ringversuch keine der Einzelproben absichtlich mit inhibitorischen Substanzen versetzt haben. Erfreulicherweise waren im Rahmen dieses Ringversuchs im Großen und Ganzen keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen und den selbstentwickelten in-house-Testsystemen zu beobachten. Trotz der relativ geringen Menge an Zielorganismen bewegten sich die Richtigkeitsquoten dabei durchwegs auf hohem Niveau mit geringer statistischer Streuung.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. folgende Testsysteme aufgeführt: BD ProbeTec (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID STD Kit (2x), GeneProof C. trachomatis PCR Kit (2x), HAIN Lifescience FluoroType CT (2x), APTIMA Combo 2 Assay von Fa. Gen Probe (1x), VERSANT CT/GC DNA Assay von Siemens (1x), InterLabService AmpliSens CT (1x), Onar CT von Minerva biolabs (1x) und Sacace Chlamydia trachomatis Real-TM (1x).

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei positive Proben mit einer hohen und einer etwa 100-fach geringeren Menge an Zielorganismen (# 1315322 mit 10⁵ CFU/mL und # 1315323 mit 10³ CFU/mL an B. pertussis), sowie zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1315321 und # 1315324) die lediglich E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielten.

Die Verfügbarkeit von offensichtlich inzwischen sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemen für den Nachweis von Bordetella pertussis DNA führte auch diesmal wieder zu durchwegs hohen Richtigkeitsquoten sowohl bei den positiven als auch bei den negativen Proben. Lediglich von einem der insgesamt 145 Teilnehmer wurde ein falsch-positives Ergebnisse für die negative Probe # 1315321 mitgeteilt. Hierbei handelt es sich offensichtlich um laborinterne Kontaminationsereignisse oder um Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung. Da diese Probe lediglich E. coli Zellen enthielt ist eine Kreuzreaktion aufgrund mangelnder Spezifität des eingesetzten PCR/NAT-Testsystems bei dieser Konstellation sehr unwahrscheinlich.

Unter den insgesamt 580 mitgeteilten NAT-Ergebnissen befanden sich zudem 6 falsch-negative klassifizierte Ergebnisse für die schwach positive Probe # 1315323 (10³ CFU/mL an B. pertussis).

Inhibitionskontrollen wurden von 142 der insgesamt 145 Teilnehmer durchgeführt und Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet.

Bei einer Menge von 10³ CFU/mL an B. pertussis Zielorganismen (entspricht ca. 10² CFU in dem für PCR-Untersuchungen typischerweise prozessierten Probenvolumen von 100 µl) nähert man sich offensichtlich der unteren Nachweisgrenze entsprechender Testsysteme an. In der mikrobiologischen Praxis sind vor allem bei Rachenabstrichen gelegentlich auch geringe Erregermengen zu erwarten – daher sollten falsch-negative Ergebnisse bei den betroffenen Teilnehmern durchaus Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben.

Wie auch bei den vorhergegangenen Ringversuchen verwendete die überwiegende Anzahl der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von B. pertussis. In diesem Zusammenhang wurde von 71 Teilnehmern explizit die Verwendung der Insertionssequenz IS481, von 12 Teilnehmern die Verwendung des Pertussis Toxin Gens und von 3 Teilnehmern die Verwendung eines ribosomalen Gensegments als B. pertussis-spezifische Zielsequenz angegeben.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP B. pertussis (7x), GeneProof B. pertussis/parapertussis PCR Kit (6x), AmpliGnost B. pertussis/parapertussis PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (6x), TIB Molbiol LightMix BP (3x), HAIN Lifescience GenoQuick Bordetella (3x), Mikrogen Diagenode B. pertussis/B. parapertussis kit (2x), B. pertussis /B. parapertussis von Cepheid (2x), RIDA GENE Bordetella Real Time PCR (2x), BactoReal B. pertussis von Ingenetix (1x), SIMPLEXA Bordetella Universal Direct Assay (1x), Seegene Seeplex Pneumobacter ACE Detection (1x), ARGENE Bordetella R-gene (1x), Vircell Speed-oligo Bordetella (1x), Bordetella Real-TM von Sacace (1x) und Attomol Bordetella DNA-LINA (2x).

Wie in Tab. 1 dargestellt (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 6), enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine positive Probe eines Clarithromycin-resistenten H. pylori (# 1315333; 1x10⁴ CFU/ml) und eine positive Probe eines Clarithromycin-sensiblen H. pylori (# 1315331; 1x10⁶ CFU/ml). Probe # 1315334 enthielt eine Kultursuspension der Spezies Campylobacter jejuni (~ 1x10⁵ CFU/ml), und Probe # 1315332 ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli.

Die Verfügbarkeit gut evaluierter NAT-gestützter Analysesysteme und die relativ hohe Menge an Zielorganismen in einer der beiden positiven Proben (# 1315331 mit ~1x10⁶ CFU/mL) führte beim Nachweis von H. pylori DNA erfreulicherweise wieder einmal zu insgesamt sehr hohen Richtigkeitsquoten.

Lediglich von einem der insgesamt 48 Teilnehmer wurde ein falsch-positives Ergebnis für die negative Probe # 1315332 mitgeteilt. Diese Probe enthielt lediglich eine Kultursuspension von E. coli und eine Kreuzreaktion aufgrund mangelnder Spezifität des eingesetzten PCR/NAT-Testsystems erscheint bei dieser Konstellation sehr unwahrscheinlich.

Bei der Probe # 1315334, die diesmal eine Kultursuspension von Campylobacter jejuni in nennenswerter Menge enthielt, wurden von allen 48 Teilnehmern korrekt negative Ergebnisse berichtet. Dies deutet auf eine gute analytische Spezifität der eingesetzten PCR Testsysteme hin. Sowohl die kommerziellen als auch die eigenentwickelten Testsysteme schnitten im aktuellen Ringversuch wieder einmal erfreulich gut ab.

Bis auf 9 Teilnehmer mit kommerziellen Testsystemen (im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ 4x GenoType Helico Kit von HAIN Lifescience, 1x Geno Sen’s Helicobacter pylori von Genome Diagnostics, 1x Diarella Helicobacter real time PCR Kit von Gerbion und 1x H. pylori Real TM von Sacace angegeben) verwendeten die Teilnehmer zum NAT-gestützten Nachweis von H. pylori selbstentwickelte, sog. in-house Testsysteme. Inhibitionskontrollen wurden von 47 der insgesamt 48 Teilnehmer durchgeführt und Inhibitionsereignisse wurden dabei von keinem Teilnehmer beobachtet.

Wie in der Testbeschreibung des RV 533 vermerkt, konnten die Teilnehmer auf freiwilliger Basis auch die vermeintliche Clarithromycin-Resistenz der untersuchten H. pylori Isolate mitteilen. Diese Spezialuntersuchung zur molekularbiologischen Resistenztestung erfolgt in der Regel über die Amplifikation und Sequenzierung von charakteristischen Bereichen innerhalb der H. pylori 23S rDNA bzw. der Sequenzanalyse dieses Genombereichs mittels Hybridisierungssonden. Ergebnisse wurden hier von 32 der insgesamt 48 Teilnehmer mitgeteilt, und bei 27 Laboratorien waren die mitgeteilten Ergebnisse der molekularen Resistenztestung auch korrekt.

Wie auch bereits bei den vorhergegangenen Runden dieses Ringversuchs mehrfach diskutiert, besteht die eigentliche Herausforderung bei dem Nukleinsäure-gestützten Nachweis von EHEC/STEC prinzipiell nicht so sehr in dem Nachweis sehr geringer Mengen an Zielorganismen, sondern vielmehr in der differenzierten Analyse und der Typisierung unterschiedlicher Shiga-Toxin-Gene und anderer putativer Pathogenitätsfaktoren (wie das für Intimin kodierende eae-Gen oder das für Enterohämolysin kodierende hlyA-Gen). Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt daher zwei unterschiedliche aber relativ stark EHEC positive Proben mit ca. 1x10⁵ CFU/mL (# 1315344: E. coli, stx₁-, stx₂-, eae-, hlyA- und O157-positiv), und mit ca. 1x10⁴ CFU/mL (# 1315343: E. coli, stx_2c- und EAEC-positiv), sowie eine Probe # 1315342 mit einem E. coli K12 Stamm (eae-, hlyA-negativ). Probe # 1315341 enthielt diesmal ca. 1x10⁴ CFU/mL Salmonella enterica Serovar Typhi.

Die Verfügbarkeit von mittlerweile bestens etablierten NAT-gestützten Testsystemen und molekularbiologischen Differenzierungsstrategien für EHEC führte hier durchwegs zu hohen Richtigkeitsquoten – sowohl für positive als auch für negative Befunde. Von 103 der insgesamt 110 Teilnehmer wurden jedoch durchwegs korrekte Ergebnisse berichtet.

Probe # 1315343 enthielt diesmal ein „überaus interessantes“ stx_2c-positives EHEC Patientenisolat, das neben dem Shiga-Toxin Gen auch entsprechende genetische Marker für Enteroaggregative E. coli (EAEC) enthält. Auch wenn diese pathogenetische Konstellation wohl eher als ungewöhnlich zu betrachten ist, soll hier an einem Beispiel aus der mikrobiologischen PCR-Routinediagnostik wieder einmal die überraschende Vielfalt an möglichen Genkonstellationen im Umfeld von EHEC-Isolaten aufgezeigt werden.

Für die 5 falsch-negativen PCR-Resultate bei dem stx-2c positiven EHEC Isolat (# 1315343) sowie den 3 falsch-negativen PCR-Befunden bei dem stx-1 und stx-2 positiven EHEC Isolat (# 1315344) gibt es keine naheliegenden Erklärungen – eventuell decken die eingesetzten Testkonzepte der entsprechenden Teilnehmer nicht das gesamte zu erwartende Spektrum an „üblichen“ stx-1 und stx-2 Genen ab. Aus wissenschaftlicher Sicht hätte man bei manchen PCR-Testsystemen allenfalls für stx-2f eine „diagnostische Lücke“ erwarten können, da dessen Gensequenz bekanntermaßen relativ wenig Homologie zu den übrigen Shiga-Toxin Gensequenzen aufweist. Aber ein stx-2f positives EHEC Isolat war diesmal ja nicht dabei…

Die Probe # 1315341 mit nennenswerten Mengen an Salmonella enterica Serovar Typhi führte erfreulicherweise bei keinem der 110 Teilnehmer zu falsch-positiven Ergebnissen.

Interessanterweise waren von den falsch-negativen EHEC Ergebnissen bei den Proben # 1315343 und # 1315344 diesmal vorwiegend Anwender mit kommerziellen Testsystemen betroffen. Da jedoch bei genauerer Betrachtung der Ergebnislage von der überwiegenden Mehrzahl der Anwender solch vorkonfektionierter und standardisierter kommerzieller PCR-Kits richtige Befunde berichtet wurden, sollten entsprechende Defizite in Einzelfällen nicht so sehr bei den Konzepten oder dem Design der PCR-Testsysteme selbst, sondern vermutlich eher auf Seiten der betroffenen Anwender gesucht werden.

Da in den meisten der teilnehmenden Laboratorien ein NAT-gestützter Nachweis von Shiga-Toxin Genen im Umfeld der EHEC-Diagnostik primär als Kulturbestätigungstest eingesetzt wird, werden bei zukünftigen Ringversuchen auch die meisten der positiven Proben wieder relativ hohe Mengen an Zielorganismen enthalten, und der Schwerpunkt bleibt auf der Abprüfung der analytischen Spezifität der eingesetzten Testsysteme und weniger auf der dabei erzielten unteren Nachweisgrenze.

Neben der stark ansteigenden Zahl an „Hain Lifescience GenoType EHEC“- und „r-biopharm RIDAGENE EHEC“-Anwendern gab die Mehrzahl der Teilnehmer nach wie vor die Verwendung von selbstentwickelten oder „anderen“ kommerziellen Testsystemen mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von EHEC an, und bei keiner der ausgesandten Proben wurden signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Zudem wurden von 99 der insgesamt 110 Teilnehmer die Ergebnisse der molekulargenetischen Shiga-Toxin Subtypisierung sowie des gezielten Nachweises von Intimin- (eae) und/oder Enterohämolysin (hlyA)-Genen mitgeteilt. Wenn auch die Typisierung nicht immer vollständig durchgeführt wurde, so waren diese Angaben zur Typisierung, zumindest in dem mitgeteilten Umfang, großteils korrekt.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: RealStar EHEC PCR Kit von Altona diagnostic (1x), r-biopharm RIDA GENE EHEC/EPEC (1x), Surefood pathogen STEC screening plus von Congen (1x) und LightMix Kit von TIB Molbiol (1x).

Wie im Rahmen dieser Ringversuchsserie bereits mehrfach angesprochen, sind die starken Schwankungen vieler etablierter Testsysteme hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität bei der Erfassung von unterschiedlichen B. burgdorferi sensu lato Genotypen bzw. auch OspA-Typen, die in Europa und Asien mit relativ hoher Inzidenz gefunden werden, nach wie vor ein zentrales Problem der NAT-gestützten Borrelien-Diagnostik. Diese Situation spiegelte sich auch in gewissem Umfang bei der Auswertung der bisherigen Ringversuche zum Nachweis von Borrelien-DNA wider. Diesmal wurde bei der Konzeption der 4 Einzelproben eine Verdünnungsreihe von B. garinii Stamm PBr angefertigt und an die Teilnehmer versandt, wie auch bereits bei einem der vorhergegangenen Probenpanels mit einem B. burgdorferi sensu stricto Stamm praktiziert.

Der aktuell eingesetzte Stamm PBr wurde aus Liquor einer Patientin mit Neuroborreliose isoliert und als B. garinii OspA-Typ 3 klassifiziert. In einer Studie konnten wir diesen OspA-Typ als zweithäufigsten B. garinii OspA-Typ in Zecken identifizieren, dagegen nur bei 8 von 242 Patientenisolaten.

Zur kurzen Rekapitulation: Mittlerweile sind 18 verschiedene dem B. burgdorferi sensu lato Komplex zugehörige Spezies beschrieben, die selbstverständlich auch entsprechende Unterschiede bei verschiedenen Zielgenen aufweisen. Von besonderem Interesse – da gesichert humanpathogen und weit in Europa verbreitet – sind B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, B. spielmanii und die aktuell als neue Spezies akzeptierte B. bavariensis. Als möglicherweise humanpathogen werden B. bissettii, B. lusitaniae und B. valaisiana eingestuft. Bezogen auf das OspA zeigt insbesondere B. garinii eine auffällige Heterogenität mit wenigstens 5 verschiedenen genetisch differenzierbaren Typen.

Im Umfeld des aktuellen Ringversuchs wollten wir uns bei der Auswahl von Art und Menge der Zielorganismen auf die Abprüfung der analytischen Sensitivität fokussieren. Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt eine Probe mit einer relativ hohen Menge an B. garinii PBr (# 1315353, ~10⁶ Organismen/mL), eine Probe mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1315352, ~10⁵ Organismen/mL), eine Probe mit etwa hundertfach geringerer Menge (# 1315351, ~10⁴ Organismen/mL) sowie eine Probe mit etwa tausendfach geringerer Menge (# 1315354, ~10³ Organismen/mL).

Die positive Probe # 1315353 (B. garinii, ~1x10⁶ Organismen/mL), wurde von 117 (98%) der insgesamt 119 Teilnehmer als positiv befundet, lediglich 2 Teilnehmer berichteten hier ein falsch-negatives Ergebnis. Probe # 1315352 mit ca. 10⁵ B. garinii Zielorgansimen/mL wurde von 112 (94%) der Teilnehmer als richtig positiv erkannt, 6 Teilnehmer berichteten ein falsch negatives, 1 Teilnehmer ein fragliches Ergebnis. Immerhin noch 108 (91%) der Teilnehmer identifizierten die Probe # 1315351 mit ca. 10⁴ Zielorgansimen/mL als richtig positiv, während 10 bzw. 1 Teilnehmer die Probe als falsch negativ bzw. fraglich beurteilten. Bei der mit 10³ Zielorgansimen/mL niedrig konzentrierten Probe # 1315354 sank die Rate der richtig positiven Ergebnisse doch deutlich auf 70% (n=83) der Teilnehmer ab. Diese Probe, die bei gutem Extraktionsprotokoll bei etwa 10¹ Genomäquivalenten pro PCR-Ansatz liegen dürfte, darf als edukative Probe eingestuft werden und Zielsituation für die eher anspruchsvollere PCR.

Falsch-negative Ergebnisse insbesondere bei den beiden hoch positiven Proben sollte den entsprechenden Teilnehmern Anlass geben, ihre Testsysteme einschließlich der Aufarbeitung und DNA-Extraktion einer eingehenderen Prüfung zu unterziehen.

Diesmal haben nur noch knapp die Hälfte der Teilnehmer selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions– und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von Borrelien-DNA verwendet, kommerzielle Testsysteme wurden von 61 der 119 Teilnehmer eingesetzt. Im Großen und Ganzen waren im Rahmen dieses Ringversuchs auch keine auffälligen Unterschiede hinsichtlich Sensitivität zwischen den jeweils eingesetzten kommerziellen (Sensitivität 93%) und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen (Sensitivität 85%) zu beobachten. Signifikante Inhibitionsereignisse der PCR-Reaktion wurde im Rahmen dieser Ringversuchsrunde von keinem der Teilnehmer beobachtet.

Darüber hinaus wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: GeneProof Borrelia burgdorferi PCR Kit (9x), EliGene Borrelia LC von Elisabeth Pharmacon (3x), Autoimmun Diagnostika GenID Zecken Screening Kit (2x), TIB Molbiol LightMix Borrelia (1x), EliGene Borrelia RT von Elisabeth Pharmacon (1x), Artus Borrelia LC Kit (1x), BactoReal B. burgdorferi von Ingenetix (1x), Attomol Borrelia burgdorferi Realtime (1x), Attomol Borrelia burgdorferi-DNA-LINA (1x), RapidSTRIPE Borrelia Assay von Analytik Jena (1x), und Borrelia real time PCR kit von Gerbion (1x).

Aufgrund zahlreicher Anfragen hier eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Legionella pneumophila aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Einzelne Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets können daher typischerweise auch relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von L. pneumophila DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt diesmal eine relativ stark positive Probe # 1315363, die mit einer Menge von ca. 10⁵ CFU/mL an Legionella pneumophila Serogruppe 3 versetzt war, sowie eine Probe mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1315364, ca. 10⁴ CFU/mL) an Legionella pneumophila Serogruppe 3. Die Probe # 1315362 des aktuellen Sets enthielt ca. 5x10⁴ CFU/mL an Legionella micdadei. Die „negative“ Probe # 1315361 des aktuellen Probensets enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich E. coli. Letztere wurde erfreulicherweise von 96 der insgesamt 98 Teilnehmer als negativ für Legionella pneumophila DNA befundet. Dies spricht wieder einmal für ein gutes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen.

Die relativ stark positive Probe # 1315363 mit ca. 10⁵ CFU/mL an Legionella pneumophila wurde diesmal von allen 98 Teilnehmern korrekterweise als positiv befundet. Die etwa 10-fach geringere Menge an Legionella pneumophila Zielorganismen in Probe # 1315363 konnte immerhin noch von 92 Teilnehmern mit ihren jeweiligen speziesspezifischen PCR-Testsystemen erfolgreich nachgewiesen werden.

Probe # 1315362 enthielt mit ca. 5x10⁴ Organismen pro mL eine nennenswerte Menge an L. micdadei, deren DNA in den jeweiligen L. pneumophila-spezifischen PCR-Testsystemen von 91 Teilnehmern keine Kreuzreaktionen und die damit verbundenen falsch-positiven Ergebnisse zeigte. Unter den 6 Teilnehmern mit falsch-positivem Ergebnis fanden sich überwiegend eigenentwickelte real-time PCR Protokolle mit 16S rDNA, dem omp- oder dem mip-Gen als spezifische Zielsequenz, sowie ein nested Block-Cycler PCR-Protokoll zur Amplifikation von spezifischen Bereichen der 16S rDNA und anschließender DNA-Sequenzierung zur Charakterisierung der Amplifikationsprodukte. Letzteres Testkonzept sollte jedoch in jedem Fall die Unterscheidung zwischen L. pneumophila und L. micdadei erlauben, zumal sich diese Spezies auf Ebene der ribosomalen Speziesmarker deutlich voneinander unterscheiden.

Falsch-positive Ergebnisse bei den Proben # 1315361 und # 1315362 sollten bei den betroffenen Ringversuchsteilnehmern zudem Anlass zur Überprüfung und Optimierung der Speziesspezifität ihres jeweiligen Helicobacter pylori-spezifischen NAT-gestützten Testsystems geben.

In Anbetracht der Reihenfolge der 4 ausgesandten Proben ist diesmal zudem das Vorliegen von Kontaminationsereignissen durch Verschleppung o.ä. aus den L. pneumophila-positiven Proben während der individuellen Probenaufarbeitung oder Prozessierung eher unwahrscheinlich (die beiden positiven Proben finden sich an Position 3 und 4 der Probenserie).

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs kamen bei insgesamt 43 Teilnehmern kommerzielle NAT-Testsysteme für den Nachweis von L. pneumophila DNA im Untersuchungsmaterial zum Einsatz. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bac Kit von (10x), AmpliGnost L. pneumophila von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (5x), GeneProof L. pneumophila PCR Kit (3x), Mikrogen Diagenode Lpn-050 Kit (3x), Seegene Seeplex PneumoBacter ACE detection (2x), Immundiagnostik MutaREX L. pneumophila (1x), TIB Molbiol LightMix Legionella (1x), Ingenetix Bacto Real L. pneumophila (1x), Minerva Onar Lp (1x), Gerbion diarella Legionella real time PCR Kit LC und TM(1x), Congen Sure Aqua L. pneumophila (1x) und Euroclone Duplica Real Time L. pneumophila Detection Kit (1x).

Von den anderen Teilnehmern wurden selbstentwickelte (in-house) NAT Testsysteme verwendet. Inhibitionskontrollen wurden von 96 der 98 Teilnehmer durchgeführt, und Inhibitionsereignisse wurden diesmal bei 3 der insgesamt 392 mitgeteilten Testergebnisse beobachtet.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt je zwei Proben mit relativ hoher Menge an Salmonella enterica Serovar Typhi (# 1315371 mit ~1x10⁵ CFU/mL und # 1315372 mit ~1x10⁴ CFU/mL) sowie eine Probe mit Salmonella enterica Serovar Enteritidis (# 1315374 mit ~5x10⁵ CFU/mL) und eine Probe ohne Zielorganismen (# 1315373), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Die Verfügbarkeit von spezifischen und mittlerweile gut evaluierten selbstentwickelten bzw. kommerziellen NAT-gestützten Analysesystemen führte diesmal bei allen 4 Proben des Ringversuchssets zu sehr hohen Richtigkeitsquoten. Insgesamt waren lediglich drei falsch-negative Ergebnisse bei den positiven Proben # 1315372 und # 1315374 sowie ein falsch-positives Ergebnis bei der „negativen Probe“ # 1315373 zu beobachten. Im direkten Vergleich zu manchen der vorhergehenden Ringversuchsrunden deutet dies auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Hoffentlich bestätigt sich diese erfreuliche Beobachtung auch in den zukünftigen Ringversuchsrunden.

Zusammenfassend wurden im Rahmen dieses Ringversuchs zum NAT-gestützten Nachweis von Salmonellen von den insgesamt 11 Teilnehmern 10 korrekte Ergebnisse bei der negativen Probe # 1315373 sowie bei der positiven Probe # 1315371 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen mitgeteilt. Lediglich die etwas schwächer positive Probe (# 1315372; Salmonella enterica ser. Typhi, ~1x10⁴ CFU/mL) wurde von 2 Teilnehmern falsch-negativ befundet und bei der Probe # 1315374 (Salmonella enterica ser. Enteritidis ~5x10⁵ CFU/mL) wurde ein falsch-negatives Ergebnis mitgeteilt. Die Richtigkeitsquoten lagen somit wieder erfreulich hoch.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ von einem Teilnehmer die Verwendung des folgenden Kits aufgeführt: Diarella Salmonella real time PCR Kit von Gerbion (1x).

In enger Abstimmung mit unserem Sollwert-Laboratorium am Bayerischen Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Oberschleißheim, werden wir weiterhin versuchen, ab und an ein etwas exotischeres Serovar von Salmonella enterica zu versenden und zumindest eine der 4 Proben mit einer relativ geringen Menge an Zielorganismen zu versetzen – auch wenn im Rahmen der gesetzlichen Vorschriften und/oder Richtlinien der einzelnen Fachgesellschaften derzeit noch keine genauen unteren Nachweisgrenzen für den NAT-gestützten Salmonellen-Nachweis festgelegt wurden.

Neben der wohl prominentesten Spezies Listeria monocytogenes sind auch eine Reihe weiterer Listerienspezies bekannt, für die inzwischen auch einige selbstentwickelte und kommerzielle NAT-gestützte Nachweisverfahren zur Verfügung stehen. Auch wenn diese Spezies (mit Ausnahme von L. ivanovii) zumeist nicht von humanpathogener Relevanz sind, werden wir uns bei der Konzeption des Probenmaterials für RV 538 vor allem zur Abprüfung der Spezifität individueller Testsysteme nicht nur auf L. monocytogenes beschränken. Daher werden gelegentlich auch andere Listerienspezies in der einen oder anderen Probe dieses Ringversuchs zu finden sein. So wie im Fall der Probe # 1315381, die diesmal eine relativ hohe Menge an L. ivanovii enthielt. Im Gegensatz zu einigen der vorhergegangenen Ringversuche, bei denen durch die nahezu ausschließliche Verwendung von L. monocytogenes-spezifischen NAT-Testsystemen bestimmte Proben bei keinem der Teilnehmer zu positiven Ergebnissen geführt hatte, wurde die Probe mit L. ivanovii von drei der insgesamt 31 Teilnehmer als positiv für Listeria spp. DNA getestet. Hintergrund dieser zumindest auf den ersten Blick etwas irritierenden Ergebniskonstellation in der statistischen Auswertung (Tab. 2, siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 11) ist die fast ausschließliche Verwendung von L. monocytogenes-spezifischen NAT-Testsystemen, die keine selektive Detektion bzw. differenzierte Erfassung von non-monocytogenes Listerienspezies erlauben. Im Umkehrschluss spricht diese Datenlage dann für eine erfreulich hohe Spezifität der eingesetzten L. monocytogenes-spezifischen Testsysteme bei 30 der insgesamt 31 Teilnehmer. Bei diesem Ringversuch besteht nämlich explizit die Option einer differenzierten Befundmitteilung. Hält ein Teilnehmer lediglich ein L. monocytogenes-spezifisches NAT-Verfahren vor, so kann er dies über den Zusatzcode [71] im Ergebnisfeld angeben, und für die Erstellung des individuellen Zertifikats seitens INSTAND e.V. werden dann auch nur die L. monocytogenes-spezifischen Ergebnisse zur Bewertung herangezogen.

Im aktuellen Ringversuch sollte über die Aussendung von einer Probe mit relativ geringer Menge an L. monocytogenes Zielorganismen wieder einmal die untere Nachweisgrenze der derzeit eingesetzten Testsysteme abgeprüft werden. Probe # 1315384 enthielt folglich mit ~ 1x10⁴ CFU/mL eine relativ geringe Menge an L. monocytogenes, die erfreulicherweise von nahezu allen Teilnehmern mit ihren jeweiligen spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert werden konnte. Lediglich einer der insgesamt 31 Teilnehmer berichtete hier ein negatives Ergebnis – vermutlich wurde in diesem Fall ein Testsystem mit unzureichender analytischer Sensitivität verwendet. Bei die Proben ohne Zielorganismen (# 1315382 und # 1315383), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielten, wurden im Rahmen des aktuellen Ringversuchs keine falsch-positiven Ergebnisse beobachtet.

Da wir uns innerhalb dieses Ringversuchsprogramms gelegentlich auch mit einzelnen Proben an die derzeit technisch machbare untere Nachweisgrenze annähern wollen (Anmerkung: wir sind uns dabei sehr wohl bewusst, dass bei vielen Fragestellungen das „technisch machbare“ nicht unmittelbar gleichbedeutend mit dem „diagnostisch sinnvollen“ ist), bestand beim aktuellen Listerien-Ringversuch die diagnostische Herausforderung in der Abprüfung der analytischen Spezifität individueller Testkonzepte. Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit dem aktuellen Ringversuch auch wieder standardisierter Rückstellproben mit non-monocytogenes Listerien zur Verfügung, die direkt über den Ringversuchsleiter zu beziehen sind.

Von allen 31 Teilnehmern wurden Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen verwendet. Vermeintliche Inhibitionsereignisse bei der Aufarbeitung und Analyse der Ringversuchsproben wurden nicht beobachtet. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: AmpliGnost L. monocytogenes von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (1x) und Diarella Listeria real time PCR Kit TM von Gerbion (1x).

Zuerst einmal, wie gehabt, eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für den Direktnachweis von MRSA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise Nasenabstrichen) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen an entsprechenden Zielorganismen. Für interessierte Teilnehmer soll an dieser Stelle noch einmal explizit darauf hingewiesen werden, dass sich mit Testsystemen, die üblicherweise für die Kulturbestätigung von S. aureus und/oder MRSA ausgelegt sind, diese geringen Mengen nicht immer zuverlässig nachweisen lassen werden. Eine Teilnahme an diesem Ringversuch ist daher nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von MRSA etabliert haben bzw. im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Nach den zugegebenermaßen etwas umfangreichen und ausführlichen Diskussionen der Ergebniskonstellationen vorhergegangener MRSA Ringversuche kann die Auswertung des aktuellen Ringversuchs erfreulich kurz gehalten werden. Da wir diesmal, abgesehen von der „interessanten“ Probe #1315393, keine „schwierigen“ oder komplexen Probenkonstellationen (die jedoch in der täglichen Praxis bekanntermaßen durchaus vorkommen können) versandt haben, wurden von den insgesamt 259 Teilnehmern mit ihren unterschiedlichsten NAT-gestützten Testsystemen nahezu durchgehend korrekte PCR Ergebnisse für 3 der insgesamt 4 Proben des aktuellen Panels berichtet.

Wie in Tab. 1 der statistischen Auswertung dargestellt (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 12), enthielt die Probe # 1315393 eine relativ niedrige Menge eines sog. LA-MRSA Patientenisolats (lifestock associated (LA-)MRSA; PVL-negativ; ~1x10³ CFU/mL). Probe # 1315391 enthielt ein typisches MRSA Patientenisolat (MRSA; PVL-negativ, ~1x10⁴ CFU/mL). Probe # 1315394 enthielt diesmal ein Methicillin-resistentes Staphylococcus haemolyticus Isolat (~1x10⁴ CFU/ml). Die letzte der 4 Proben, # 1315392, enthielt neben humanem Zellmaterial lediglich eine nennenswerte Menge an E. coli.

Auch wenn sich in der MRSA-positiven Probe # 1315391 eine relativ hohe Menge an entsprechenden Zielorganismen befand, so ist die diesmal beobachtete Richtigkeitsquote von 99% als durchaus respektabel zu bezeichnen. Erfreulicherweise wurden für diese Probe von 256 der insgesamt 259 Teilnehmer korrekt positive Ergebnisse mitgeteilt. Der Hintergrund des einen als „fraglich“ klassifizierten Ergebnisses bei dieser Probe ist seitens des Ringversuchsleiters nicht näher zu ergründen.

Auch die beiden MRSA-negativen Proben # 1315392 und # 1315394 wurden von jeweils 257 bzw. 252 Teilnehmern mit ihren PCR-gestützten MRSA-spezifischen Testsystemen als „negativ“ getestet. Lediglich ein Teilnehmer beobachtete bei der Probe # 1315392 ein falsch-positives Ergebnis und ein Teilnehmer hatte sein Ergebnis hier als „fraglich“ klassifiziert.

Die insgesamt 7 falsch-positiven Ergebnisse bei der Probe # 1315394 (mecA-positiver S. haemolyticus) könnten wohl am ehesten auf isoliert auftretende Kontaminationsereignisse mit MRSA DNA während der Probenaufarbeitung oder Amplifikation bzw. Detektion verursacht worden sein. Auch eine mangelnde analytische Spezifität der verwendeten Testsysteme könnte hier als Ursache für mögliche Kreuzreaktionen in Frage kommen – im Gegensatz zu manch früheren Ringversuchsrunden (bei denen auch Proben mit Gemischen aus mecA-positiven Coagulase-negativen Staphylokokken und mecA-negativen S. aureus Isolaten ausgesandt wurden) ist in dieser Probe neben dem Oxacillin-resistenten CoNS jedoch kein MSSA anwesend.

Aber solche „Ausreißer“ sind bei technisch aufwändigen Ringversuchen mit über 200 Teilnehmern nichts Ungewöhnliches und bedürfen meines Erachtens keiner weiteren Diskussion. Insgesamt bleibt festzuhalten, dass der erfreulich große Anteil von richtig-positiven Ergebnissen bei der einen positiven Probe und die überwiegend richtig-negativen Befunde bei den 2 MRSA-negativen Proben erneut für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminations- und Verschleppungsereignissen spricht.

Die augenscheinlich „schlechte Datenlage“ bei der MRSA-positiven Probe # 1315393 ist bei näherer Betrachtung schnell erklärt. Hierbei handelt es sich um ein S. aureus Patientenisolat, das mit molekulargentischen Typisierungsverfahren den sogenannten lifestock associated (LA)-MRSAs zugeordnet wird. Kurz gesagt handelt es sich hierbei um bestimmte Oxacillin-resistente S. aureus Isolate, charakteristischerweise vom MLST Typ 398, die auf Gesamtgenomebene alle üblicherweise verwendeten S. aureus Marker sowie ein funktionelles mecA Gen mit typischer Gensequenz tragen, sich in der SCCmec-orfX Region aber auf Sequenzebene geringfügig von den „typischen“ MRSA Isolaten unterscheiden. Diese Sequenzunterschiede können unter Umständen dazu führen, dass solche LA-MRSA Isolate nicht mit allen kommerziellen oder in house SCCmec basierten PCR-Testsystemen sicher erfasst und/oder auch eindeutig als MRSA detektiert werden können. Wie die Bezeichnung schon vermuten lässt, finden sich solche Isolate vermehrt im landwirtschaftlichen oder veterinärmedizinischen Bereich und gewinnen dadurch auch aus diagnostischer Sicht (z.B. bei der Definition von „Risikogruppen“ für PCR-gestütztes MRSA Aufnahmescreening) zunehmend an Bedeutung.

LA-MRSA Isolate werden derzeit hauptsächlich in Schweinebeständen, aber auch bei anderen Nutztieren beobachtet. Die mit dem zunehmenden Auftreten solcher LA-MRSA Isolate verbundene Problematik wird in der aktuellen Literatur sowohl unter infektiologischen als auch epidemiologischen Gesichtspunkten diskutiert und hat mittlerweile auch schon in die MRSA-Screeningkriterien (Definition von „Risikopatienten") Einzug gefunden. Literaturstellen wären hier beispielsweise: [1], [2].

Aus diagnostischer Sicht ist möglicherweise auch die einfache Differenzierungsmöglichkeit von LA-MRSA Isolaten mit bestimmten in-house oder kommerziell verfügbaren PCR Testsystemen interessant [3].

Im aktuellen Ringveruch wurden bei der LA-MRSA Probe # 1315393 von 246 Teilnehmern korrekt positive Ergebnisse mitgeteilt, bei 10 Teilnehmern wurde jeweils ein falsch-negatives Ergebnis beobachtet und 3 Teilnehmer haben das Ergebnis ihrer MRSA-spezifischen PCR als „fraglich“ klassifiziert. Letztere 3 Teilnehmer gaben die Verwendung des Roche „LC MRSA Advanced“ Testkits an. Da bei diesem real-time PCR Testsystem beim Vorliegen von LA-MRSA Isolaten ein abweichender Schmelzpunkt der Hybridization Probes zu beobachten ist (siehe zuvor aufgeführte Euro Surveillance-Veröffentlichung), ist die Klassifizierung der Ergebnisse als „fraglich“ bei Probe # 1315393 methodisch auch vollkommen nachvollziehbar.

Ungeachtet des verwendeten PCR/NAT-Testsystems wurde bei der Erstellung der Zertifikate aufgrund der relativ geringen Menge an Zielorganismen im Probenmaterial ein negatives MRSA Ergebnis für die besagte LA-MRSA Probe ausnahmsweise nicht als „falsch-negativ“ bewertet. Die 10 Teilnehmer mit falsch-negativen Ergebnissen bei Probe # 1315393 sollten dies jedoch dennoch als Anlass zur Überprüfung und Optimierung der Spezifität bzw. Sensitivität ihres jeweiligen MRSA-spezifischen NAT-gestützten Testsystems nehmen.

Abgesehen von der zuletzt diskutierten Probe spricht die Ergebnislage dieses Ringversuchs erneut für eine hohe Zuverlässigkeit des NAT-gestützten Direktnachweises von MRSA aus klinischem Untersuchungsmaterial. Für Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen interessiert sind, stehen mit den Proben dieses Ringversuchs wieder standardisierte Rückstellproben zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Optional wird im Rahmen unserer Ringversuchsreihe auch der molekulargenetische Nachweis des putativen Pathogenitätsfaktors PVL (Panton-Valentine Leukozidin) bzw. dessen kodierende Gene lukF/S-PV abgefragt. Entsprechende Ergebnisse wurden von 184 der insgesamt 259 teilnehmenden Laboratorien mitgeteilt und mit Ausnahme eines Teilnehmers waren diesmal die (negativen) Ergebnisse für die molekularbiologische PVL-Testung durchwegs korrekt. Nähere Informationen zu der nach wie vor hochaktuellen cMRSA bzw. CA-MRSA Problematik finden sich beispielsweise unter [4], [5]. Ein gut evaluiertes real-time PCR Protokoll für den gezielten Nachweis von PVL-positiven S. aureus Isolaten findet sich beispielsweise in [6].

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde hier unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ u.a. die Verwendung folgender Kits aufgeführt: HAIN Lifescience FluoroType MRSA (6x), BD Max GeneOhm MRSA (5x), Alere detect ready MRSA Panel Plus (5x), HAIN Lifescience Genotype MRSA (3x), HAIN Lifescience Genotype Staphylococcus (3x), r-biopharm RIDAGENE MRSA PCR (3x), r-biopharm test kit (1x), Sentosa SA MRSA PCR test von VELA diagnostics (1x), Autoimmun Diagnostika Gen ID MRSA combi (1x), Congen Sure line MRSA (1x) und Diarella MRSA real time PCR Kit TM von Gerbion (1x).

Eine wichtige Anmerkung vorab: dieser Ringversuch ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Chlamydia pneumoniae DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut (wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial) konzipiert. Die positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets enthalten daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen. Aus diesem Grund ist eine Teilnahme an diesem Ringversuch nur für solche diagnostische Laboratorien erfolgversprechend und sinnvoll, die hochsensitive und spezifische NAT/PCR-gestützte Verfahren zum Direktnachweis von C. pneumoniae DNA etabliert haben oder solche im Zuge einer externen Qualitätskontrolle evaluieren wollen.

Wie in Tab. 1 dargestellt (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 14), enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal eine Probe mit sehr hoher Menge an entsprechenden Zielorganismen (# 1315402; Chlamydia pneumoniae, ~1x10⁶ IFU/ml) und eine Probe mit etwa tausendfach geringerer Menge (# 1315404; Chlamydia pneumoniae, ~1x10³ IFU/ml), eine Probe mit ca. ~1x10⁶ CFU/ml an Legionella pneumophila (# 1315401), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1315403), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt.

Wie bereits in den vorhergegangenen Ringversuchen zu beobachten war, so wird bei der Auswertung der Ergebnisse auch diesmal die hervorragende analytische Sensitivität und Spezifität der gegenwärtig eingesetzten und z.T. auch bereits sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesysteme für den Nachweis von C. pneumoniae DNA eindrucksvoll aufgezeigt. Aus den in der Tab. 2 aufgeführten Daten (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 14) ist zu entnehmen, dass im aktuellen Ringversuch alle Teilnehmer die Zielorganismen in der positiven Probe # 1315402 sicher und zuverlässig nachweisen konnten.

Mit ca. 10³ IFU pro mL Probenmaterial enthielt die Probe # 1315404 diesmal eine relativ geringe Menge an C. pneumoniae Zielorganismen. Erfreulicherweise wurde diese Probe dennoch von 104 der insgesamt 109 Teilnehmer als (richtig-) positiv befundet.

Aufgrund der relativ geringen Menge an Zielorganismen wurden die mitgeteilten Ergebnisse diesmal nicht in die Bewertung für die Zertifikate mit einbezogen. Dies ist auch durch die beiden grau schraffierten Felder in Tab. 2 gekennzeichnet (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 14). Angesichts der mit 1x10³ IFU/mL ehrlicherweise nicht gerade als „äußerst gering“ zu bezeichnenden Menge an Zielorganismen sollten falsch-negative Ergebnisse bei Probe # 1315404 den betroffenen 5 Ringversuchsteilnehmern dennoch Anlass zur Überprüfung und Optimierung ihres jeweiligen NAT-gestützten Testsystems geben. Denn aus vergleichbaren Proben der Ringversuche im April 2009 und November 2008 mit einer Menge von ca. 10² IFU/mL an C. pneumoniae im Probenmaterial (die damals nur noch von ca. zwei Drittel der Teilnehmer erfolgreich detektiert werden konnten) wird deutlich dass die untere Nachweisgrenze der gegenwärtig eingesetzten und z.T. auch bereits sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesystemen für den Nachweis von C. pneumoniae DNA wohl eher bei 10² IFU/mL als bei 10³ IFU/mL an C. pneumoniae angesiedelt ist.

Erfreulicherweise wurden für die Probe # 1315401 (Legionella pneumoniae) von keinem der insgesamt 109 Teilnehmer falsch-positive Ergebnisse berichtet.

Bei der negativen Probe # 1315403 (nur E. coli) wurden von 107 Teilnehmern korrekt negative Ergebnisse berichtet. Bei den verbleibenden 2 falsch-positiven Ergebnissen handelt es sich vermutlich um laborinterne Kontaminationsereignisse oder um Kreuzkontaminationen während der Probenextraktion und -abarbeitung. Kreuzreaktivitäten der C. pneumoniae-spezifischen PCR Testsysteme mit E. coli erscheinen eher als unwahrscheinlich.

Bis auf einen Teilnehmer haben alle entweder kommerzielle oder selbstentwickelte (in-house) Testsysteme mit Inhibitions- und/oder Positivkontrollen zum NAT-gestützten Nachweis von C. pneumoniae DNA verwendet; eine signifikante Inhibition der PCR-Reaktion bei den vier versandten Proben innerhalb des aktuellen Ringversuchs wurde dabei von keinem der Teilnehmer beobachtet. Aufgrund des leider noch relativ geringen Anteils und der nicht durchgehenden Spezifizierung von kommerziellen Testsystemen innerhalb des Teilnehmerfeldes lassen sich derzeit keine seriösen Vergleiche zwischen bestimmten kommerziellen Kits und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit führen. Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 13 Teilnehmern die Verwendung des TIB Molbiol LightMix C. pneumoniae Testsystems, von 8 Teilnehmern der Diagenode MP/CP Kit und von 2 Teilnehmern der kommerzielle AmpliGnost CP PCR Kit angegeben. Bis auf ein einzelnes falsch-negatives Ergebnis bei Verwendung des Diagenode MP/CP Kits konnten damit alle Teilnehmer durchwegs Richtigkeitsquoten von 100%, sowohl für die positiven als auch für die negativen Proben erzielen.

Unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ wurde im Kommentarfeld des Ergebnisformulars u.a. die Verwendung folgender Testkits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bac Kit (8x), GeneProof C. pneumoniae PCR Kit (7x), AmpliGnost C. pneumoniae PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (5x), Mikrogen Diagenode Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae Real Time PCR (2x), Biomerieux Argene Chla/Myco pneumo r-gene (2x), Immundiagnostik MutaPLATE C. pneumoniae (1x), Vircell Speed-oligo Chlamydophila pneumoniae (1x), Seegene Seeplex (1x), Ingenetix Bacto Real Chlamydophila pneumoniae (1x) und Mikrogen FTD Real Time PCR (1x).

Aufgrund zahlreicher Rückfragen von Teilnehmern des vergangenen Ringversuchs hier eine wichtige Anmerkung vorab: der Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Mycoplasma pneumoniae ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Mycoplasma pneumoniae DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsgut, wie beispielsweise respiratorischem Probenmaterial, konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten. Dieses Mal waren jedoch keine Proben mit geringen Mengen an Zielorganismen im ausgesandten Probenset vertreten ;-)

Wie in Tab. 1 dargestellt (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 15), enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal drei positive Proben in einer Art Verdünnungsreihe. Eine Probe mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (# 1315414; M. pneumoniae, ~10⁶ Genomkopien/mL), eine mit ca. zehnfach geringerer Menge (# 1315412; M. pneumoniae, ~10⁵ Genomkopien/mL), eine Probe mit ca. hundertfach geringerer Menge (# 1315413; M. pneumoniae, ~10⁴ Genomkopien/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1315411), die nur humanes Zellmaterial und E. coli enthielt.

Insgesamt betrachtet wurden von den Teilnehmern im Rahmen der aktuellen Ringversuchsrunde zumindest für 3 der insgesamt 4 Proben wieder erfreulich hohe Richtigkeitsquoten erzielt. Mit Ausnahme eines Teilnehmers konnten diesmal alle der insgesamt 119 Teilnehmer die DNA der M. pneumoniae Zielorganismen in der relativ stark positiven Probe # 1315414 problemlos und zuverlässig nachweisen. Der zuverlässige Nachweis von M. pneumoniae DNA in der etwas schwächer positiven Probe # 1315412 gelang allen 119 Teilnehmern. Selbst bei der schwach positiven Probe # 1315413 (ca. 10⁴ Genomkopien/mL) wurden lediglich von 8 Teilnehmern falsch-negative Ergebnisse beobachtet. Zwei Teilnehmer klassifizierten ihr Ergebnis hier als „fraglich".

Die „negative“ Probe # 1315411, die anstelle von Zielorganismen lediglich E. coli enthielt, wurde diesmal von nahezu allen Teilnehmern mit ihren jeweiligen M. pneumoniae-spezifischen Testsystemen als negativ befundet. Bei dem einen falsch-positiven Ergebnis handelt es sich entweder um laborinterne Kontaminationsereignisse, um eine Kreuzkontamination während der Probenextraktion und -abarbeitung oder um Kreuzreaktivitäten, die in der Verwendung von Testsystemen mit unzureichender Spezies-Spezifität begründet sein könnten.

Insgesamt deutet diese Ergebnislage auf eine verbesserte Vorgehensweise hinsichtlich der Vermeidung von Kontaminationsereignissen während der individuellen Probenaufarbeitung und PCR/NAT-Analytik in den teilnehmenden diagnostischen Laboratorien hin. Hoffentlich bestätigt sich diese erfreuliche Beobachtung auch in den zukünftigen Ringversuchsrunden (und nicht nur dann, wenn sich diese negative Probe als Nummer 1 innerhalb des so versandten und vermutlich auch so abgearbeiteten 4-er Sets befindet).

Die diagnostische Performance eines etablierten in-house Protokolls und ausgewählter kommerzieller NAT-Testsysteme zum Nachweis von M. pneumoniae DNA wurde im Sollwertlabor für RV 541 (Prof. Jacobs und Dr. Dumke, Dresden) im Rahmen einer systematischen Studie untersucht. Auch hier erwiesen sich diese Testsysteme als spezifisch, sensitiv und auch zuverlässig bezüglich der Erfassung aller relevanten M. pneumoniae Subtypen und Varianten [7].

Im Rahmen des aktuellen Ringversuchs wurde von 56 Teilnehmern die Verwendung von kommerziellen Testkits aufgeführt: LightMix M. pneumoniae [n=10], Minerva Venor Mp Testsystem [n=1], AmpliGnost MP PCR Kit [n=2], Diagenode MP/CP [n=9], sowie „andere kommerzielle Testsysteme“ [n=34]. Teilnehmer mit den ersten drei der aufgeführten Testkits konnten damit durchwegs Richtigkeitsquoten von 100%, sowohl für die positiven als auch für die negativen Proben erzielen. Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [27] „Andere kommerzielle Testsysteme“ zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: Autoimmun Diagnostika Gen ID CAP Bac Kit (7x), GeneProof M. pneumoniae PCR Detection Kit (6x), AmpliGnost M. pneumoniae PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (4x), Mikrogen Diagenode Mycoplasma/Chlamydophila pneumoniae Real Time PCR (2x), Biomerieux Argene Chla/Myco pneumo r-gene (2x), Minerva biolabs Intego PCR Kit (1x), Vircell Speed-oligo Mycoplasma pneumoniae (1x), Immundiagnostik MutaREAL M. pneumoniae (1x), Seegene PneumoBacter ACE detection (1x), Ingenetix Bacto Real Mycoplasma pneumoniae (1x), Mikrogen FTD Real Time PCR (1x) und Mikrogen FTD Respiratory pathogens 21 (1x).

Dieser seit kurzem neu ins Ringversuchsprogramm aufgenommene kombinierte Ringversuch Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Coxiella burnetti & Bacillus anthracis ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Coxiella burnetii und Bacillus anthracis DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets werden daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Das aktuelle Set an Ringversuchsproben enthielt zwei Proben mit verschiedenen Mengen an Coxiella burnetii (~1x10³ Genomkopien/mL in Probe # 1315421 und ~1x10⁵ Genomkopien/mL in Probe # 1315422), zwei Proben mit 10-fach unterschiedlicher Menge an Bacillus anthracis DNA (~5x10³ Genomkopien/mL in Probe # 1315421 und ~5x10⁴ Genomkopien/mL in Probe # 1315424), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1315423), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Der Übersichtlichkeit halber haben wir uns bei diesem kombinierten Ringversuch entschlossen, die Ergebnislage für die beiden unterschiedlichen Erreger auch in zwei getrennten Tabellen darzustellen: für Coxiella burnetii in Tab. 2 und 3 sowie für Bacillus anthracis in Tab. 4 und 5 (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 16 und 17).

Die etwas stärker positive Probe # 1315422 mit ca. 10⁵ Genomkopien C. burnetii /mL wurde diesmal von allen der insgesamt 21 Teilnehmer als positiv befundet. Auch die Probe # 1315421 des aktuellen Probesets mit einer etwa hundertfach geringeren Menge an C. burnetii, wurde ebenfalls von nahezu allen Teilnehmern mit ihren jeweiligen C. burnetii-spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert. Lediglich ein Teilnehmer (der die Verwendung eines nicht näher spezifizierten in house PCR Testsystems im Ergebnisbogen aufgeführt hat) berichtete hier ein falsch-negatives Ergebnis.

Diese Ergebnislage deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen aus den vorherigen Ringversuchen – Schwierigkeiten beim zuverlässigen Nachweis von C. burnetii DNA traten damals erst bei Proben mit weniger als ca. 10³ Genomkopien pro mL auf. Diese untere Nachweisgrenze bestätigt sich offenbar auch im aktuellen Ringversuch.

Anmerkung des Ringversuchsleiters: Bei einer DNA-Aufreinigung aus 100 µl Probenmaterial, einer Elution in 100 µl (also ca. 100 Genomkopien in 100 µl) und der Verwendung von 5 µl template input entspricht diese Menge ca. 5 Genomkopien pro NAT-Reaktionsansatz. Abhängig von der verwendeten Zielsequenz des jeweiligen PCR-Testkonzepts muss dabei noch die Kopienzahl der entsprechenden Zielsequenz im Genom berücksichtigt werden (z.B. liegen ribosomale Gene wie die 16S rDNA typischerweise in 2 bis 10 Kopien pro Bakteriengenom vor und bei den unterschiedlichen erregerspezifischen Zielsequenzen muss zwischen sog. multi-copy und single-copy targets differenziert werden).

Neunzehn der insgesamt 21 Teilnehmer gaben die Verwendung eines eigenentwickelten (in house) PCR Testkonzepts an; bei drei dieser Teilnehmer war explizit das „Transposase Gen (IS1111)“ als Zielsequenz vermerkt. Zwei der Teilnehmer verwendeten den vorkonfektionierten LightMix C. burnetti Kit der Fa. TIB Molbiol (Berlin) und beobachteten hiermit durchgehend korrekte Ergebnisse.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von C. burnetti DNA aller Teilnehmer enthielten eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Die Ergebnislage des im Rahmen der aktuellen Ringversuchsrunde neu eingeführten Ringversuchs „Bacillus anthracis DNA“ ist relativ schnell dargestellt und diskutiert.

Alle der 10 Teilnehmer konnten mit ihren jeweils vor Ort etablierten Bacillus anthracis spezifischen PCR/NAT-gestützten Testsystemen die beiden positiven Proben mit ca. 5x103 Genomkopien/mL (# 1315421) und mit ca. 5x10⁴ Genomkopien/mL (# 1315424) an Bacillus anthracis DNA erfolgreich nachweisen.

Ebenfalls von allen der 10 Teilnehmer wurden korrekt negative Ergebnisse für die Proben ohne entsprechende Zielorganismen # 1315423 (nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen) sowie # 1315422 (nur Coxiella burnetii mit ca. 10³ Genomkopien/mL und eine Suspension aus humanen Zellen) beobachtet. Insgesamt doch wohl eine sehr erfreuliche Gesamtsituation…

Und zudem stehen nach erfolgreichem Abschluss der aktuellen Ringversuchsrunde den Kolleginnen und Kollegen, die an einer aussagekräftigen Abprüfung der Spezifität und Sensitivität von neu- oder eigenentwickelten Testsystemen für B. anthracis DNA interessiert sind, mit den Proben dieses Ringversuchs auch gewissermaßen „standardisierte Rückstellproben“ zur Verfügung, die über den Ringversuchsleiter bezogen werden können.

Dieser ebenfalls seit kurzem neu ins Ringversuchsprogramm aufgenommene Ringversuch „Bakteriengenomnachweis PCR/NAT Francisella tularensis“ ist ausschließlich für die Abprüfung von NAT-gestützten Methoden und Protokollen zum Direktnachweis geringer Mengen an Francisella tularensis DNA aus geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien konzipiert. Einige der positiven Proben innerhalb des ausgesandten 4-er Sets haben daher typischerweise relativ geringe Mengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Wie in Tab. 1 dargestellt (siehe Anhang 1 [Anh. 1], S. 18), enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben diesmal nur zwei positive Proben: Probe # 1315432 mit relativ hoher Menge an Zielorganismen (F. tularensis, ~1x10⁶ CFU/mL) und Probe # 1315433 mit ca. hundertfach geringerer Menge (F. tularensis, ~1x10⁴ Genomkopien/mL). Im Ringversuchsprobenset befanden sich zudem zwei Proben ohne Zielorganismen (# 1315431 und # 1315434), die nur humane Zellen und E. coli enthielten.

Ähnlich wie bei dem zuvor diskutierten Ringversuch haben auch hier alle der 11 Teilnehmer die relativ stark positive Probe # 1315432 mit ihren NAT-gestützten Testsystemen korrekt identifiziert. Gleichfalls wurden die F. tularensis-negativen Proben # 1315431 und # 1315434 von allen Teilnehmern erfreulicherweise durchgehend als negativ befundet. Dies spricht für ein gutes Funktionieren sowohl der bei den jeweiligen Teilnehmern etablierten Testsysteme als auch der implementierten laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen.

Auch die im Vergleich zu # 1315432 etwa hundertfach schwächer F. tularensis-positive Probe # 1315433 des aktuellen Probesets wurde von nahezu allen Teilnehmern mit ihren jeweiligen spezifischen PCR-Testsystemen zuverlässig detektiert. Lediglich zwei der 11 Teilnehmer (einer mit kommerziellem Testsystem und einer mit einem eigenentwickelten in house PCR Testkonzept) berichteten hier ein falsch-negatives Ergebnis. Diese Ergebnislage deckt sich weitgehend mit den Beobachtungen bezüglich unterer Nachweisgrenzen aus vorherigen Ringversuchen.

Die selbstentwickelten oder kommerziellen Testsysteme zum NAT-gestützten Nachweis von F. tularensis DNA aller Teilnehmer enthielten eine Inhibitions- und/oder Positivkontrolle. Bei keiner der ausgesandten Proben wurden dabei signifikante Inhibitionsereignisse beobachtet.

Auch wenn die Anzahl der teilnehmenden Laboratorien bei der aktuellen Ringversuchsrunde noch nicht sehr hoch ist, so kann die aktuelle Ergebniskonstellation als orientierender Hinweis darauf angesehen werden, dass die untere Nachweisgrenze der gegenwärtig eingesetzten und z.T. auch bereits sehr gut evaluierten NAT-gestützten Analysesysteme für den Nachweis von F. tularensis DNA unterhalb einer Menge von ca. 10⁴ Organismen/mL Probenmaterial liegen dürfte.

Der RV 560 „Pilzgenomnachweis PCR/NAT Pneumocystis jirovecii“ war so konzipiert, dass er der RV-Leitung einen Überblick über die verfügbaren NAT-gestützten Methoden und Protokolle zum Direktnachweis von Pneumocystis jirovecii DNA in geeignetem klinischem Untersuchungsmaterialien verschaffen sollte. Zum orientierenden Herantasten an die unteren Nachweisgrenzen der im Anwenderkreis etablierten PCR/NAT-gestützten Testsysteme enthielt das aktuelle Set an Ringversuchsproben drei positive Proben in einer Art von Verdünnungsreihe (siehe auch Tab. 1 (Anhang 1 [Anh. 1], S. 19)): eine Probe mit hoher Menge an Zielorganismen (# 1315601; Pneumocystis jirovecii, ca. 3x10⁶ Genomkopien/mL), eine mit etwa zehnfach geringerer Menge (# 1315602; Pneumocystis jirovecii, ca. 4x10⁵ Genomkopien/mL), eine mit etwa hundertfach geringerer Menge (# 1315603; Pneumocystis jirovecii, 3x10⁴ Genomkopien/mL), sowie eine Probe ohne Zielorganismen (# 1315604), die nur E. coli und eine Suspension aus humanen Zellen enthielt.

Erfreulicherweise hat sich auch in der aktuellen Ringversuchsrunde die überaus gute Ergebnislage des im November 2012 durchgeführten Proberingversuchs bestätigt.

Sowohl die relativ stark positive Probe # 1315601 mit ca. 3x10⁶ Genomkopien/mL sowie die etwa 10-fach schwächer positive Probe # 1315602 mit ca. 4x10⁵ Genomkopien/mL wurde von allen der insgesamt 66 Teilnehmer als positiv befundet. Selbst in der DNA-Präparation aus der etwas schwächer positiven Probe # 1315601 (ca. 3x10⁴ Genomkopien/mL) gelang noch nahezu allen der teilnehmenden Laboratorien ein sensitiver und spezifischer Nachweis von Pneumocystis jirovecii DNA mit ihren jeweils etablierten qualitativen oder quantitativen PCR-Testsystemen. Lediglich einer der insgesamt 66 Teilnehmer berichtete bei dieser Probe ein falsch-negatives Ergebnis – vermutlich wurden in diesen Fällen Testsysteme mit etwas schlechterer analytischer Sensitivität verwendet. Bei der Probe ohne Zielorganismen (# 1315604), die ausschließlich humanes Zellmaterial und eine nennenswerte Menge an E. coli enthielt, wurden im Rahmen des aktuellen Ringversuchs keine falsch-positiven Ergebnisse beobachtet. Dies spricht unter anderem für ein hervorragendes Funktionieren von Test- bzw. laborspezifischen Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationsereignissen.

Im Kommentarfeld des Ergebnisformulars wurde unter Code [26] „Andere kommerzielle Testsysteme" zusätzlich die Verwendung folgender Kits aufgeführt: AmpliGnost P. jirovecii PCR Kit von Priv. Inst. für Immunologie und Molekulargenetik Karlsruhe (4x) und TIB Molbiol LightMix Pneumocystis jirovecii (1x).

Nicht zuletzt aufgrund dieser erfreulichen Ergebnislage werden sich in den zukünftig ausgesandten 4-er Sets auch immer positive Proben befinden, die relativ geringe Genommengen der entsprechenden Zielorganismen enthalten.

Aufgrund der noch relativ geringen Teilnehmerzahl bei den Ringversuchen RV 542, RV 543 und RV 560 sowie der nicht durchgehenden Spezifizierung von kommerziellen Testsystemen innerhalb des Teilnehmerfeldes lassen sich derzeit noch keine seriösen Vergleiche zwischen bestimmten kommerziellen Kits und der, zumindest aus methodischer Sicht, relativ heterogenen Gruppe von selbstentwickelten (in-house) Testsystemen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität oder Kontaminationsanfälligkeit führen.