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Genetische Modifikation humaner mesenchymaler Stammzellen zur Steigerung des osteogenen Potentials
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Published: | October 23, 2013 |
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Fragestellung: Die Therapie von Knochendefekten kritischer Größe, die ein kompromittiertes, intrinsisches Regenerationspotential aufweisen, stellt ein schwerwiegendes Problem dar. Die Forschung auf dem Gebiet der Knochenheilung hat sich in jüngster Vergangenheit daher auf die Anwendung mesenchymaler Vorläuferzellen (MSZ) zur Stimulierung des Knochenwachstums konzentriert. Vielversprechende Ergebnisse aus in vitro Studien oder in Kleintiermodellen ließen sich jedoch im Menschen meist nicht reproduzieren. In der vorliegenden Studie wurde daher in humanen MSZ eine Überexpression spezifischer Wachstumsfaktoren induziert mit dem Ziel, deren osteogenes Potential zu steigern.
Methodik: Humane MSZ wurden nach etablierten Protokollen isoliert und expandiert. Durch adenovirale Transfektion wurde eine Überexpression von grün fluoreszierendem Protein (GFP, Kontrolle), indian hedgehog (IHH), bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) und IHH/BMP-2 induziert. Die Zellen wurden für 28 Tage mit osteogenem Differenzierungs- und Kontrollmedium kultiviert. Als weitere Kontrolle dienten native MSZ. Auswirkungen auf die metabolische Aktivität (Alamar Blau), die Proliferation (Qubit® dsDNA BR), die Aktivität des Enzyms alkalische Phosphatase (ALP)(p-Nitrophenylphosphat), die Mineralisierung in Zellkultur (Alizarinrot S) sowie auf die Expression charakteristischer, osteogener Markergene wurden untersucht (qRT-PCR). Die statistische Analyse der Daten erfolgte mittels ANOVA (IBM SPSS 19.0) und p-Werte <0,05 wurden als signifikant erachtet.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Über die ersten 72h nach Transfektion wurde eine leichte, nicht signifikante Abnahme der metabolischen Aktivität in allen Gruppen beobachtet. Das Proliferationsverhalten der transfizierten und nativen MSZ unterschied sich nicht signifikant. Die Aktivität der ALP zeigte ein typisches Rise-and-Fall Muster, mit einer frühen, maximalen Aktivität an Tag 14 und 21 nach osteogener Induktion. Alle osteogen induzierten Gruppen wiesen eine signifikant höhere ALP-Expression und Aktivität auf als die Kontrollen. Die Überexpression von BMP-2 und IHH+BMP-2 bewirkte eine signifikant stärkere Mineralisierung an Tag 28. In den qRT-PCR Untersuchungen zeigte sich für BMP-2 ost und IHH+BMP2 ost ein signifikanter Anstieg der Osteopontin und BMP-2 Expression über die Zeit sowie an Tag 28 bzw. 21 eine signifikant höhere Expression als in allen anderen Gruppen. Zudem konnte bei allen ost Gruppen ein Anstieg der Runx2 Expression bis Tag 21 festgestellt werden. Dieser war im Verhältnis am stärksten für BMP-2 ost und IHH+BMP-2 ost.
Die virale Transfektion hatte insgesamt keinen negativen Einfluss auf die metabolische Aktivität der Zellen oder deren Proliferationsverhalten. Die Überexpression von BMP-2 ohne oder in Kombination mit IHH führte zu einer gesteigerten Produktion mineralisierter, extrazellulärer Matrix und zu einer gesteigerten Genexpression osteogener Marker. Die virale Transfektion stellt daher eine vielversprechende Möglichkeit dar, das osteogene Potential von MSZ zu steigern.